Гистологическая окраска нервной ткани

Содержание темы

В гистологии, цитологии и эмбриологии существует много методов исследования.

Здесь рассматриваются лишь те, которые связаны со световой и электронной микроскопией мёртвых (фиксированных) клеток и тканей .

1.1. Световая микроскопия

1.1.1. Устройство микроскопа

1. Оптическая система включает объектив и окуляр.

а ) Объектив (1) - это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и непосредственно направляемая на объект (отсюда - и название).

Схема - строение светового микроскопа.

в) Результирующее увеличение микроскопа - произведение увеличений объектива и окуляра, например:

г) Таким образом, функция оптической системы -

а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне микроскопа (пример - обычная настольная лампа).

в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей.

г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине.

а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты .

1.1.2. Приготовление гистологического препарата

а) срезы органов (толщиной 5-15 нм),
б) мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр., селезёнки),
в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты

Чаще всего используются срезы.

2. Приготовление препарата обычно включает 4 следующих этапа:

а) взятие и фиксация материала,
б) обезвоживание и уплотнение материала,
в) приготовление срезов,
г) окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду.

1.1.2.1. Взятие и фиксация материала

2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей.
Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков .

1.1.2.2. Обезвоживание и уплотнение материала

2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань).

а) Для этого их “проводят” по батарее спиртов -

б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле.

3. Заливка : помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин

1.1.2.3. Приготовление срезов

1. Кубики вставляют в специальный прибор - микротом , - служащий для приготовления срезов.

2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм).

б) А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины.

1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду

(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)

2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами

1.1.2.5. Мазки и тотальные препараты: особенности приготовления

2. В подобных случаях, а также при приготовлении мазков, из 4-х перечисленных в п. 1.1.2. этапов опускаются два -

1.1.3. Методы окрашивания гистологических препаратов

1.1.3.1. Типы красителей

Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-

Существует большое количество различных способов окраски.
Те из них, которые встречаются в нашем курсе, перечислены ниже.

1.1.3.2. Общие методы окраски

б) Сочетает основной и кислый красители.

в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры.

2. Ядра пр иобретают сине-фиолетовый цвет,
цитоплазма - желтовато-розовый цвет.

2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет.

3. Хорошо выявляются

1.1.3.3. Выявление неклеточных структур соединительной ткани

а) Краситель - смесь растворов пикриновой кислоты и кислого фуксина.

1. Краситель является трёхцветным: это смесь

а также двух кислот.

2.а ) Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-синий цвет ;

1. а) Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем - восстановителями.

б) В итоге, выделяющееся серебро осаждается на определённых волокнах соединительной ткани. –

1. Используется для окраски костей и дентина.

б) Краситель - раствор тионина.

3 . а) Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет;

1.1.3.4. Окраска клеток соединительной ткани и крови

б) Отличия же от приготовления срезов таковы:

1.1.3.5. Выявление элементов нервной системы

2. При окрашивании срез последовательно обрабатывают растворами

1.1.4. Гистохимические методы исследования

а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата.
б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива.

1. Реактив (как отмечалось, - смесь двух красителей:
метилового зелёного и пиронина.

2. а ) А. Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет .
Б. Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет.

б) Другие структуры ядра (помимо ядрышек) - зелёные .

1. Основной реактив - фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа).

1. Реактив - Ш ифф-пер и одная к ислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК ).

2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа.

1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия

- изменение окраски с синей на фиолетовую и красную.

2. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты аморфного вещества соединительной ткани - гликозамингликаны

(являющиеся, как известно, гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов).

1.1.5. Просмотр препаратов

1.1.5.1. Срез; окраска гематоксилин-эозином

1. На снимке мы видим внутреннюю поверхность тонкой кишки с находящимися на ней кишечными ворсинками ( 1).

2. а) Ядра клеток (2) - базофильны и окрашены гематоксилином в фиолетовый цвет.

1.1.5.2. Тотальный препарат: окраска судан III - гематоксилином

1. а) Препарат является тотальным.

б) Это означает, что перед нами - не срез органа, а участок сальника, растянутого на предметном стекле.

1.1.5.3. Срез после декальцинации; окраска по Шморлю

1. В процессе изготовления препарата костный материал подвергнут декальцинации (п. 1.1.3.3).

2. Применённый метод окраски позволяет выявить
стенки костных полостей (1) и канальцев (2) , окрашивающиеся в тёмно-коричневый цвет благодаря высокому содержанию здесь коллагеновых волокон.

1.1.5.4. Срез; окраска по Маллори

1. В методе Маллори используются 3 красителя (п. 11.3.3), что делает картину многоцветной.

2. На снимке - женская половая клетка (ооцит), находящаяся в фолликуле яичника.

3. Цитоплазма (1) клетки окрашена в розовый ,

окружающая её блестящая оболочка (2 ) - в голубой ,

1.2. Электронная микроскопия

Если в световом микроскопе увеличение составляет 100-1000 раз,
то в электронном микроскопе - 10.000 –100.000 раз (и выше), т.е. примерно в 100 раз больше .

1.2.1. Принцип работы электронного микроскопа

1.2.1.1. Особенности:
электронная волна, электромагнитные "линзы"

1.2.1.2. Ход лучей

1. а) Источником электронов служит катод (1) ,

а движущей силой - разность потенциалов между катодом и анодом (2).

б) Анод расположен вблизи катода и имеет отверстие посередине, через которое проскакивают электроны.

I

II

б) вторая катушка (5) - в качестве объектива (принимает лучи, расходящиеся от образца),

1.2.2. Особенности приготовления препарата

2. а) Заливку производят в специальных формах,

б) затвердевание смеси происходит путём её полимеризации в термостате,

б) Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны.

КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ

Ускоренный метод окрашивания миелиновых волокон и нервных клеток по Викторову

Депарафинированные срезы окрашивают в течение 1 —2 ч в 0,01 % кислом спиртовом растворе люксолевого синего прочно­го, дифференцируют в 0,1 % растворе тетрабората натрия (буры) и докрашивают крезиловым фиолетовым прочным по Нисслю.

Растворы красителей и их изготовление. Раствор I: 1 г люк­солевого синего прочного, 5 мл ледяной уксусной кислоты, до 100 мл 96 % спирта. Для приготовления рабочего 0,01 % раствора

1 мл основного раствора красителя смешивают со 100 мл 96 % спи­рта. Рабочий раствор красителя можно использовать повторно.

Раствор II: 250 — 500 мг крезилового фиолетового прочного, 130 мг ацетата натрия, 1,2 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды. Забуференный раствор крези­лового фиолетового прочного для подкрашивания по Нисслю можно использовать неоднократно.

1. Наклеенные на стекла парафиновые срезы толщиной 10 — 20 мкм депарафинируют в ксилоле и промывают в 100 % и 96 % спиртах.

2. Окрашивают в 0,01 % спиртовом растворе люксолевого си­него прочного 1 — 2 ч при 56 — 60 °С.

3. Промывают срезы последовательно в 96 % и 70 % спиртах и дистиллированной воде.

4. Дифференцируют в 0,1 % растворе тетрабората натрия, контролируя процесс под микроскопом (краситель постоянно удаляется из среза, а миелиновые волокна сохраняют яркую сине-зеленую окраску).

5. Ополаскивают в 5 % растворе уксусной кислоты.

6. Окрашивают крезиловым фиолетовым прочным в течение 2 — 5 мин.

7. Промывают в дистиллированной воде.

8. Обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %), просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Результат: миелин ярко-синего цвета; вещество Нисс ля, ядра нейронов, глиоцитов, клеток сосудов и оболочек мозга фиолетовые.

Метод избирательной импрегнации дегенерированных нервных волокон и окончаний

Фиксацию мозга лабораторных животных проводят методом прижизненной перфузии 10 % раствором нейтрального формалина на изотоническом растворе хлорида натрия через левый желудочек сердца. После перфузии мозг дополнительно фиксируют в тече­ние 10—14 дней в 10 % растворе нейтрального формалина, а за 1 — 2 дня перед резкой помещают в 30 % раствор сахарозы, что предупреждает повреждение ткани при замораживании. В раство­ре формалин-сахарозы мозг может храниться долго.

Срезы толщиной 25 — 40 мкм, полученные на замораживаю­щем микротоме, собирают в 10 % раствор формалина, в котором и хранят до последующей обработки.

Растворы и их приготовление. А. Кислый раствор соли пяти­валентного ванадия: навеску в 1,2 г метаванадата аммония (аммо­ний ванадиевокислый) растворяют в 150 — 200 мл горячей дис­тиллированной воды, после охлаждения раствора к нему добав­ляют 5 мл концентрированной серной кислоты и доводят его объем до 1000 мл. Удобно готовить также концентрированный раствор: 12 г метаванадата аммония растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды. К полученному раствору после охлаж­дения небольшими порциями добавляют 50 мл концентрирован­ной серной кислоты и доводят его объем до 1000 мл. Если при до­бавлении серной кислоты выпадает бурый осадок пятиокиси ва­надия, то его растворяют при нагревании. Перед применением к 1 части концентрированного раствора добавляют 9 частей дистил­лированной воды. Кислый раствор метаванадата аммония может храниться в течение длительного времени. Б. Раствор нитрата серебра 3 %.

В. Аммиачно-натриевый раствор: в 100 мл 25 % водного рас­твора аммиака растворяют 1,25—1,5т гидроксида натрия. Рас­твор хранят в плотно закрытой склянке с полиэтиленовой проб­кой.

Г. Раствор аммиачного серебра (готовят перед использовани­ем): к 50 мл 3 % аммиачного серебра добавляют б мл аммиачно-натриевого раствора.

Д. Редуцирующий раствор: 27 мл 10 % формалина, 87 мл 1 % лимонной кислоты, 90 мл 96 % спирта, до 1000 мл дистиллирован­ной воды.

Е. Смесь равных объемов 1 % раствора тиосульфата натрия и 1 % раствора сульфита натрия.

1. Срезы промывают в течение 5 мин в 2 сменах дистиллиро­ванной воды.

2. Помещают в кислый раствор метаванадата аммония на 10— 15 мин.

3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды 5 мин.

4. Переносят на 25 — 30 мин в 3 % раствор нитрата серебра (срезы приобретают светло-коричневый цвет). Далее каждый срез обрабатывают отдельно.

5. Ополаскивают в дистиллированной воде (5— 10 смен).

6. Помещают на 1 — 2 мин в раствор аммиачного серебра.

7. Без предварительного промывания проводят через 2 смены редуцирующего раствора (1-я смена — 1 мин, 2-я смена — 2 — 3 мин).

8. Промывают 1 — 2 мин в дистиллированной воде.

9. Помещают на 1 — 2 мин в смесь равных объемов 1 % рас­творов тиосульфата натрия и сульфита натрия.

10. Тщательно промывают в 2 сменах дистиллированной воды в течение 10—15 мин.

11. Промытые срезы наклеивают на предметные стекла спир­товым раствором желатина и хромовых квасцов (в 200 мл 0,5 % раствора желатина растворяют 100 мг хромовых квасцов; чис­тые предметные стекла погружают в этот раствор, вынимают и сушат в вертикальном положении). Наклеенные и хорошо про­сушенные срезы обезвоживают спиртом, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Примечания. 1. Продолжительность обработки срезов, описанной в пунктах 2, 4, 6, определяют опытным путем для каждой серии срезов.

2. Качество препаратов значительно улучшается, если срезы, наклеенные на предметные стекла, докрасить растворами крези-лового фиолетового прочного или толуидинового синего.

Результат: фон препаратов светло-желтый, реже коричне­вый; дегенерированные волокна — черные; в местах окончания дегенерированных волокон выявляют тела нервных клеток и ядра нейроглии, имеющие различные оттенки фиолетового цвета.

Методика дифференцированного выявления нейронов и глии на парафиновых срезах

Гистохимические методы, в частности методы определения бел­ковых веществ, не позволяют дифференцировать типы глии, поскольку обычно у глиальных клеток различимы только структу­ры ядра. Ставя задачу разработать метод дифференцированно­го определения нейронов и глиальных элементов на гистохими­ческих препаратах, авторы попытались объединить метод Альцгеймера, предназначенный для выявления митохондрий, нейро-сом, телец Ниссля и астроцитарной глии, и гистохимический ] метод определения общего белка с применением амидо черного 10Б. Метод Альцгеймера основан на различном сродстве органоидов клетки к красителям: в нейронах митохондрии и нейро-сомы окрашиваются в ярко-красный цвет, вещество Ниссля — в зеленый, а тела амебовидных клеток — в зеленоватый, глиаль-ные и соединительнотканные волокна — в красный. Метод с применением амидо черного 10Б позволяет обнаружить общий и суммарный белок в ткани мозга по окрашиванию его скоплений в зеленый цвет. В результате исследования разработана следую­щая схема.

Кусочки ткани мозга после фиксации в жидкости Карнуа проводят по обезвоживающим средам и заключают в парафин. Срезы толщиной 5—10 мкм приклеивают белком на предметные стекла.

1. Срезы депарафинируют и через спирты нисходящей кон­центрации доводят до воды.

2. Переносят в 0,03 % раствор амидо черного 10Б на ацетат­ном буфере (рН 5,32) при комнатной температуре на 20 мин.

3. Промывают в дистиллированной воде.

4. Инкубируют в насыщенном водном растворе кислого фук­сина при 56 °С 30 мин.

5. После охлаждения до комнатной температуры ополаскива­ют в дистиллированной воде.

6. Дифференцируют в пикриновой кислоте (15 мл насыщен­ного спиртового раствора пикриновой кислоты и 30 мл дистил­лированной воды) 15 с.

7. Ополаскивают в дистиллированной воде и обсушивают фильтровальной бумагой.

8. Дифференцируют в 100 % спирте около 2,5 с.

9. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Результат: отчетливо выявляются белки в телах и митохонд­риях нейронов, а также в ядрах глиальных клеток. Последние значительно различаются по интенсивности окраски в зависи­мости от принадлежности к тому или иному типу глии: карио­плазма и хроматиновые структуры ядер олигодендроглиоцитов интенсивно-красного цвета, а у астроцитов в красный цвет окра­шены ядрышко и небольшое количество зерен хроматина.

Метод Герлаха

Для выявления грубых отростков ганглиозных клеток и более крупных тяжей волокон рекомендуется метод Герлаха. При этом важно, чтобы препараты до окрашивания кармином не со­прикасались со спиртом.

Материал фиксируют в жидкости Мюллера или 3 — 5 % растворе бихромата калия. Продолжительность фиксации мозга птиц и лягушек составляет несколько недель, головного и спин­ного мозга человека — несколько месяцев и даже лет. Срезы получают на замораживающем микротоме и в течение несколь­ких часов промывают в воде. Окрашивают в разбавленном рас­творе аммиачного кармина 24 — 48 ч. Очень важно правильно приготовить раствор: растирают 1 г кармина, приливают 100 мл дистиллированной воды и добавляют по каплям 26 % раствор аммиака (нашатырный спирт) в таком количестве, чтобы краси­тель полностью растворился. После этого раствор должен со­зреть в открытом сосуде до полного исчезновения запаха аммиа­ка. К употреблению годны лишь растворы, стоявшие в течение длительного времени. Перед использованием основной раствор разбавляют дистиллированной водой настолько, чтобы для ок­рашивания срезов потребовалось 24 — 48 ч. Раствор кармина можно использовать повторно (со временем он даже становится лучше). Срезы дифференцируют в слабо подкисленной уксус­ной кислотой воде 1 — 2 ч; промывают, проводят через спирты возрастающей концентрации, ксилол и заключают в бальзам.

Результат: ганглиозные клетки с отростками интенсивно-красные; осевые цилиндры нервных волокон и ядра клеток красные; волокна глии розовые; мякотные оболочки остаются неокрашенными. Если срез предварительно окрасить гематокси­лином, то ядра окрашиваются контрастно в синий цвет.

Метод аксонального электрофореза солей кобальта для исследования мозга млекопитающих

Создание метода заполнения нервных структур солями кобаль­та (Со-метод) у позвоночных животных [Ри11ег Р.М., Рпог 1975] открыло широкие возможности для избирательного окрашивания определенных систем нервных клеток и волокон, напоминающего импрегнацию по методу Гольджи.

Метод отрабатывали на корешках тройничного, языкогло-точного и блуждающего нервов взрослых крыс и латеральном обонятельном тракте котов при пропускании тока 5 — 50 мкА и длительности электрофореза 2 —24 ч.

1. Животное умерщвляют внутрибрюшинным введением наркотических веществ. Все дальнейшие процедуры до окончания эксперимента обязательно проводят на холоде и используют хо­лодные растворы (4 °С). Мозг перфузируют через сердце 200 мл трис-НС1-буфера (рН 7,4), содержащего 154 мМ хлорида натрия, 5,6 мМ хлорида калия, 2,3 мМ хлорида кальция и 0,25 М сахаро­зы, быстро и осторожно достают из черепной коробки и помещают в фарфоровую чашку с таким же раствором.

2. Аксональный электрофорез солей кобальта: корешок че­репного нерва перерезают острым скальпелем, центральный конец корешка или тракта помещают в полиэтиленовую трубку, диаметр которой немного больше диаметра корешка или тракта.

Этот конец фиксируют к стенке клеем МК-6 или вазелином, ко­торый одновременно герметически закупоривает трубку с этого конца. С противоположной стороны трубки наливают 130 мМ раствор дихлорида кобальта. Составляют электрическую цепь, в которую последовательно включают батарею постоянного тока (100-АМЦГ-У-190), микроамперметр, реостат и электроды. Один платиновый электрод (плюс) помещают в раствор дихло­рида кобальта, другой (минус) — в раствор, омывающий мозг. Пропускают постоянный электрический ток силой 40 мкА в те­чение 6 ч. В процессе эксперимента через каждый час полнос­тью меняют раствор, омывающий мозг.

3. Осаждение солей кобальта: по окончании эксперимента вырезают подлежащий изучению участок мозга (размером 20х10х5 мм), который для одновременного осаждения Со2+ и фиксирования нервной ткани помещают на 10 ч в смесь, состоя­щую из 2 мл 10 % сульфида натрия и 100 мл 70 % спирта. При удачном заполнении корешка нерва или тракта почернение его наступает уже через 10 с.

4. Получение гистологических препаратов: после кратковре­менного промывания в 70 % спирте (10 мин) кусочек мозга обезвоживают в спиртах: 96 % — 1 ч, в 100 % — 1 ч, в 100 % — 2 ч; помещают последовательно в смесь 100 % спирта и хлоро­форма (1:1) и хлороформ до тех пор, пока он не опустится в каждом из этих растворов на дно сосуда, затем обычным спосо­бом заливают в парафин. Мозг режут на непрерывные серийные срезы толщиной 20 — 25 мкм, наклеиваемые белком на стекла. Срезы на стеклах депарафинируют в ксилоле и проводят по спиртам нисходящей концентрации до воды.

5. Усиление осадка сульфида кобальта: для выявления малых количеств кобальта в нервной ткани используют физи­ческий проявитель. Срезы на стеклах помещают в чашку Петри, заливают проявителем и ставят в термостат при 37 °С на 20 — 30 мин. Необходимо избегать попадания прямого солнечного света. Окрашивание доожно контролировать визуально и пре­кращать при появлении слабо-желтого или коричневого фона на стороне введения кобальта путем промывания срезов водой (не­сколько смен по 5 мин). Затем срезы обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, просветляют в ксилоле и заключа­ют в бальзам.

6. С целью выявления не содержащих кобальт и поэтому не окрашенных нервных элементов срезы можно докрашивать 0,15 % галлоцианином по Ромейсу или 0,2 % крезиловым фио­летовым по Викторову.

7. Все растворы готовят на дистиллированной воде, реакти­вы должны быть химически чистыми.

Физический проявитель состоит из раствора А — 25 % гум­миарабик, раствора В — 2 % гидрохинон в 5 % растворе лимон­ной кислоты, раствора С — 10 % раствор нитрата серебра. Растворы А, В и С можно хранить в темном прохладном месте в те­чение 2 нед. Рабочий раствор готовят непосредственно при про­явлении срезов, последовательно смешивая 10 частей А, 10 час­тей В и 0,2 части С. Гуммиарабик в растворе А можно заменить 4 % раствором желатина и рабочий раствор тогда составляют из 8 частей А, 3 частей В и 0,1 части С.

Результат: сенсорные волокна и их терминальные ветвления заполнены кобальтом и имеют четкие контуры; окрашенные нервные клетки и их аксоны легко отличимы от заметных иног­да на препарате в виде теней не заполненных кобальтом нерв­ных элементов, дендриты можно проследить на расстоянии 100— 150 мкм от тела клетки; набухания и фрагментации воло­кон, изменения формы и объема нейронов не наблюдается. Весь препарат имеет слабо-желтый фон, окрашенные волокна и клет­ки черного цвета.

Методика фотооксидации флюоресцентных препаратов секционного материала мозга человека для световой и электронной микроскопии

Для системного выявления нейронов и проводящих путей мозга человека применяют внутриклеточное введение люциферового желтого (ЛЖ) и мембранный транспорт карбоцианиновых кра­сителей, в основном 1,1-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндо-карбоцианин перхлорит (ДИЛ).

1. В секционном материале мозга человека, взятом спустя 7 — 16 ч после смерти, через микроэлектрод вводят Л Ж в пирамидные нейроны зрительной, фронтальной коры и непирамид­ные нейроны гиппокампа, а карбоцианиновые красители (в ос­новном ДИЛ) — в белое вещество или различные слои зритель­ной коры.

2. Вибратомные срезы (толщиной 75—150 мкм), окрашен­ные ЛЖ или ДИЛ, помещают в чашку Петри и прижимают к ее дну металлическим грузом; наливают раствор, состоящий из 1 мг/мл 3,3'-диаминобензидина-4 (ДАБ) и 1 мг/мл цианида калия на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4).

3. Для фотооксидации чашку Петри со срезами помещают под флюоресцентный микроскоп. Используют эпифлюоресцен-цию через объективы с увеличением в 6,3 или 10 раз и соответ­ствующие светофильтры: для Л Ж — максимум возбуждения 470 нм, для ДИЛ — 546 нм.

4. Через 1 — 2 ч (время колеблется в зависимости от плотнос­ти освещения, толщины препаратов и флюоресцентного вещества) срезы мозга промывают 3 раза фосфатным буфером. Можно проводить несколько процедур фотооксидации на одном и том же срезе, каждый раз меняя раствор.

5. Для проведения световой микроскопии срезы помещают на предметные стекла, смазанные белком, высушивают, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

6. Для осуществления электронной микроскопии срезы поме­щают на 7 — 10 мин в 0,5 % раствор тетраоксида осмия на фос­фатном буфере, промывают 3 раза тем же буфером, обезвожи­вают в спиртах восходящей концентрации и заключают между двумя целлофановыми листочками.

7. Срезы, окрашенные ЛЖ, дополнительно контрастируют в урани л ацетате. Срезы, окрашенные ДИЛ, этой процедуре не подвергают, так как в этом случае на электронно-микроскопи­ческом уровне невозможно отличить мембраны, окрашенные ДИЛ, от мембран, контрастированных уранилацетатом.

Результат: выявляются пучки аксонов с коллатералями и бусинками по ходу, очень четко окрашиваются также отдельные терминальные волокна с бусинками по ходу или шипикоподоб-ными образованиями; нейроны выявляются со всеми деталями. На электронограммах нейроны и дендриты, окрашенные ЛЖ, имеют более темный профиль.

Использование метода фотооксидации позволяет преобразовать флюоресцентные препараты в световые, которые также годны для электронной микроскопии.

Методы выявление элементов нервной, жировой. Эластических структур. Гистохимия.

Окрашивание нервной тканиПри морфологических исследованиях нервной ткани на светооптическом уровне применяют большое количество методов окрашивания, многие из которых модифицированы. Чаще всего это избирательные (элективные) методы, используемые для выявления одного или двух элементов. С определенной целью применяют комбинированные методы.

ФИКСАЦИЯПри изучении нервной ткани из простых фиксаторов наиболее часто используют 10 — 20 % раствор формальдегида и 96 % и 100 % спирт, из фиксирующих смесей — сулему и пиридин. Существуют также специфические фиксаторы, применяющиеся только при исследовании элементов нервной ткани.

Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления глии):

нейтральный формалин 15 мл бромид аммония 20 г

дистиллированная вода 85 мл

Смесь применяют для серебрения глии по Рамон-и-Кахалю —Хортеге. Продолжительность фиксации тонких (до 1,5 см) кусочков материала 2 — 15 дней. Промывание в проточной воде.

Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления нейро-фибрилл):

пиридин 40 мл? 96 % спирт 30 мл

Продолжительность фиксации 2 ч. Промывание в проточной воде в течение 1 ч.

ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

Особенностью обработки нервной ткани является ее тщательное обезвоживание. Для обезвоживания кусочков толщиной 5 —б мм используют следующую схему:

100 % спирт I 6 ч

100% спирт II 6 ч

Продолжительность обезвоживания 32 ч

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАЛИВКИ НЕРВНОЙ ТКАНИ

Нервную ткань для гистологического исследования заливают в парафин, целлоидин и желатин. Методика заливки в парафин и целлоидин никаких особенностей обработки нервной ткани на этой стадии нет.

Заливка в желатин по СнесаревуМетод пригоден для эмбриологических исследований. Преимущество его заключается в том, что он не вызывает сморщивания материала. Рекомендуется для выявления тонкой межклеточной структуры соединительной ткани, а также для некоторых цитологических исследований.

Для заливки берут бесцветный прозрачный пищевой желатин и вначале из него готовят 25 % раствор. Для этого мелко нарезают нужное количество желатина, насыпают в широкогорлую банку и ставят в термостат при 37 °С до растворения. После этого часть приготовленного желатина разводят пополам теплым 1 % раствором фенола (карболовой кислоты) и таким образом получают 12,5 % раствор. Растворы желатина лучше готовить в небольших количествах по мере надобности. После фиксации тщательно промытый материал переносят в 12,5 % раствор желатина, где держат в зависимости от величины кусочков от 1 — 2 ч до 1 — 2 сут, затем на такое же время переносят в 25 % раствор желатина при 37 °С. После заливки следуют быстрое охлаждение в холодильнике и уплотнение в 5— 10 % формалине. Блоки режут только на замораживающем микротоме.

Гистохимия, раздел гистологии, изучающий химические свойства тканей животных и растений. Задача Г. — выяснение особенностей обмена веществ в тканевых клетках (см. Клетка) и межуточных средах. Она изучает изменения свойств клеток в процессе развития, связи между работой, метаболизмом и обновлением зрелых клеток и тканей. Основной принцип гистохимических методик — связывание определённого химического компонента клеток с красителем или образование окраски в процессе реакции. Ряд методов (цитофотометрия, люминесцентная и интерференционная микроскопия) исходит из физических свойств веществ. С помощью разных гистохимических методов можно определить локализацию и количество многих веществ в ткани, их метаболизм (тканевая авторадиография), связи с субмикроскопической структурой (электронная Г.), активность ферментов. Перспективным направлением является также иммуногистохимия. Наиболее точные гистохимические методы, позволяющие исследовать структуры клетки, называют цитохимическими (см. Цитохимия).

Первые специальные гистохимические исследования принадлежат французскому учёному Ф. Распайлю (1825—34). Интенсивно Г. стала развиваться с 40-х гг. 20 в., когда появились надёжные методы определения в клетке белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов, некоторых неорганических компонентов. С помощью гистохимических методик удалось, например, впервые показать связь изменений количества РНК с синтезом белка и постоянство содержания ДНК в хромосомном наборе.

4. Виды микроскопии.

Методы световой микроскопии
Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.

Метод светлого поля и его разновидности
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д.

Метод темного поля и его разновидности
Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры не окрашенного материала. При этом лучи от осветителя падают на препарат под косым углом, и объект исследования проявляется освещенным в темном поле..

Метод фазового контраста
При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные - фаза световой волны, что и используют для получения высоко контрастного изображения.

Поляризационная микроскопия
Поляризационная микроскопия позволяет изучать ультраструктурную организацию тканевых компонентов на основе анализа анизотропии и/или двойного лучепреломления

Метод интерференционного контраста
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором

Метод исследования в свете люминесценции
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами.

Ультрафиолетовая микроскопия. Основана на применении ультрафиолетовых лучей с длиной волны менее 380 нм, что позволяет увеличить разрешающую способность объективов с 0,2. 0,3 мкм до 0,11 мкм. Требует применения специальных ультрафиолетовых микроскопов, в которых используются ультрафиолетовые осветители, кварцевая оптика и преобразователи ультрафиолетовых лучей в видимую часть спектра. Многие вещества, входящие в состав клеток (например, нуклеиновые кислоты), избирательно поглощают ультрафиолетовые лучи, что используется для определения количества этих веществ в клетке.