Вектор бест диагностика клещевого энцефалита

СЕ-марка на набор для определения интерлейкина-6 Подробнее

Получена СЕ марка на ИФА-наборы для диагностики Крымской-Конго геморрагической лихорадки. Подробнее

ID] => 2343 [TIMESTAMP_X] => 18.06.2019 09:49:14 [

TIMESTAMP_X] => 18.06.2019 09:49:14 [MODIFIED_BY] => 9321 [

MODIFIED_BY] => 9321 [DATE_CREATE] => 18.06.2019 09:49:14 [

DATE_CREATE] => 18.06.2019 09:49:14 [CREATED_BY] => 9321 [

CREATED_BY] => 9321 [IBLOCK_ID] => 17 [

IBLOCK_ID] => 17 [IBLOCK_SECTION_ID] => 2342 [

IBLOCK_SECTION_ID] => 2342 [ACTIVE] => Y [

ACTIVE] => Y [GLOBAL_ACTIVE] => Y [

GLOBAL_ACTIVE] => Y [SORT] => 2800 [

SORT] => 2800 [NAME] => Клещевой энцефалит [

NAME] => Клещевой энцефалит [PICTURE] => [

PICTURE] => [LEFT_MARGIN] => 53 [

LEFT_MARGIN] => 53 [RIGHT_MARGIN] => 54 [

RIGHT_MARGIN] => 54 [DEPTH_LEVEL] => 3 [

DEPTH_LEVEL] => 3 [DESCRIPTION] => [

DESCRIPTION] => [DESCRIPTION_TYPE] => text [

DESCRIPTION_TYPE] => text [SEARCHABLE_CONTENT] => КЛЕЩЕВОЙ ЭНЦЕФАЛИТ [

SEARCHABLE_CONTENT] => КЛЕЩЕВОЙ ЭНЦЕФАЛИТ [CODE] => [

SOCNET_GROUP_ID] => [LIST_PAGE_URL] => /prod/index.php [

LIST_PAGE_URL] => /prod/index.php [SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2343 [

SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2343 [IBLOCK_TYPE_ID] => products [

IBLOCK_TYPE_ID] => products [IBLOCK_CODE] => catalog [

IBLOCK_CODE] => catalog [IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [

ELEMENT_CNT] => 3 [ELEMENT_CNT] => 3 [IPROPERTY_VALUES] => Array ( ) [PATH] => Array ( [0] => Array ( [ID] => 2316 [

ID] => 2316 [CODE] => root_ifa [

CODE] => root_ifa [XML_ID] => [

EXTERNAL_ID] => [IBLOCK_ID] => 17 [

IBLOCK_ID] => 17 [IBLOCK_SECTION_ID] => [

IBLOCK_SECTION_ID] => [SORT] => 100 [

SORT] => 100 [NAME] => Иммуноферментная диагностика [

NAME] => Иммуноферментная диагностика [ACTIVE] => Y [

ACTIVE] => Y [DEPTH_LEVEL] => 1 [

DEPTH_LEVEL] => 1 [SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2316 [

SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2316 [IBLOCK_TYPE_ID] => products [

IBLOCK_TYPE_ID] => products [IBLOCK_CODE] => catalog [

IBLOCK_CODE] => catalog [IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [

IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [GLOBAL_ACTIVE] => Y [

GLOBAL_ACTIVE] => Y [IPROPERTY_VALUES] => Array ( ) ) [1] => Array ( [ID] => 2342 [

EXTERNAL_ID] => [IBLOCK_ID] => 17 [

IBLOCK_ID] => 17 [IBLOCK_SECTION_ID] => 2316 [

IBLOCK_SECTION_ID] => 2316 [SORT] => 2700 [

SORT] => 2700 [NAME] => Природно-очаговые и зоонозные инфекции [

NAME] => Природно-очаговые и зоонозные инфекции [ACTIVE] => Y [

ACTIVE] => Y [DEPTH_LEVEL] => 2 [

DEPTH_LEVEL] => 2 [SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2342 [

SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2342 [IBLOCK_TYPE_ID] => products [

IBLOCK_TYPE_ID] => products [IBLOCK_CODE] => catalog [

IBLOCK_CODE] => catalog [IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [

IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [GLOBAL_ACTIVE] => Y [

GLOBAL_ACTIVE] => Y [IPROPERTY_VALUES] => Array ( ) ) [2] => Array ( [ID] => 2343 [

EXTERNAL_ID] => [IBLOCK_ID] => 17 [

IBLOCK_ID] => 17 [IBLOCK_SECTION_ID] => 2342 [

IBLOCK_SECTION_ID] => 2342 [SORT] => 2800 [

SORT] => 2800 [NAME] => Клещевой энцефалит [

NAME] => Клещевой энцефалит [ACTIVE] => Y [

ACTIVE] => Y [DEPTH_LEVEL] => 3 [

DEPTH_LEVEL] => 3 [SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2343 [

SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2343 [IBLOCK_TYPE_ID] => products [

IBLOCK_TYPE_ID] => products [IBLOCK_CODE] => catalog [

IBLOCK_CODE] => catalog [IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [

IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [GLOBAL_ACTIVE] => Y [

GLOBAL_ACTIVE] => Y [IPROPERTY_VALUES] => Array ( ) ) ) ) [SECTIONS_COUNT] => 0 )

ВектоВКЭ-IgМ

Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу клещевого энцефалита.

ВектоВКЭ-антиген

Набор реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса клещевого энцефалита.

ВектоВКЭ-IgG

Набор реагентов для иммуноферментного выявления и количественного определения иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита.

• Описание
• Состав
• Показания для применения
• Режим дозирования и способ применения
• Меры предосторожности при применении

Набор реагентов ИФА ТС АГ ВКЭ Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса клещевого энцефалита (Комплект № 1) включает следующие реагенты для проведения прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА):
ИГ - иммуносорбент – иммуноглобулин класса G (крысиный) против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) – аморфный порошок белого цвета, после растворения – прозрачная или слабоопалесцирующая бесцветная жидкость.
КА+ - контрольный положительный образец – антиген ВКЭ, экстрагированный из ткани мозга мышей, инфицированных ВКЭ, инактивированный бетапропиолактоном -аморфный порошок кремового цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесци-рующая светло-желтого цвета жидкость.
КА– - контрольный отрицательный образец – антиген из ткани мозга неинфицированных мышей, аморфный порошок кремового цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесцирующая светло-желтого цвета жидкость.
Конъюгат (концентрат) – иммуноглобулин класса G против ВКЭ (крысиный), конъюгированный с пероксидазой хрена, аморфный порошок белого цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесцирующая бесцветная жидкость.
КББ×20 - 20-кратный концентрат карбонатно-бикарбонатного буферного раствора для разведения ИГ – прозрачная бесцветная жидкость.
ФСБ-Т×25 – 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином, раствор для промывания планшетов и приготовления раствора РР – прозрачная или слабо опалесцирующая бесцветная жидкость, в которой допускается выпадение кристаллов бело-го цвета, растворимых в течение 20-30 мин при температуре 37 ºС.
БСА - бычий сывороточный альбумин – стабилизатор – аморфный порошок от белого до светло-желтого цвета, после растворения в ФСБ-Т – прозрачная или слабо опалесциру-ющая светло-желтого цвета жидкость.
ЦБР - буферный раствор с перекисью водорода – раствор для разведения ТМБ – про-зрачная бесцветная жидкость.
ТМБ - концентрат тетраметилбензидина – хромоген – прозрачная бесцветная жид-кость.
Планшеты полистироловые 96-луночные монолитные для ИФА.

Комплект № 1 рассчитан на одновременное проведение 192 определений, включая контрольные.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
Оборудование, материалы и реагенты (не включенные в состав набора), необ-ходимые для проведения анализа:
- многоканальный спектрофотометр, позволяющий измерять оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 450 нм;
- термостат, поддерживающий температуру (37±1) ºС;
- холодильник бытовой;
- промыватель для микропланшет, ручной или полуавтоматический;
- дозаторы (пипетки) переменного объема (механические или электронные): 8- или
12-канальные с объемом дозирования от 50 до 300 мкл и 1- канальные с объемом до-зирования от 10 до 100 мкл, от 100 до 1000 мкл и от 500 до 5000 мкл;
- наконечники для дозаторов соответствующей вместимости;
- шейкер (встряхиватель лабораторный медицинский V-3 типа вортекс);
- часы;
- бумага фильтровальная;
- перчатки резиновые хирургические;
- стаканы химические мерные или колбы мерные вместимостью 50 мл и 500 мл;
- цилиндры мерные вместимостью 25 мл, 100 мл, 500 мл;
- вода дистиллированная или вода очищенная;
- кислота серная концентрированная.
Вся посуда, используемая для постановки реакции, должна быть химически чистой и не содержать ионов тяжелых металлов. Следует избегать непосредственной близости с хлорсодержащими дезинфектантами, особенно на этапах приготовления ТМБ. Для отбора исследуемых образцов и реагентов тест-системы необходимо использовать автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5 %. Отбор реагентов следует произ-водить чистыми наконечниками для автоматических пипеток.

Подготовка исследуемого материала.

Обработка клещей.
Для испытания в ИФА пригодны лишь неповрежденные клещи. Клещей однократно промывают 70 % спиртом этиловым и 2-3 раза 0,9 % раствором натрия хлорида. Каждого клеща помещают в пробирку для микропроб вместимостью 0,5-1,5 мл, маркируют и хранят до исследования при температуре не выше минус 20 ºС не более 2 недель. Перед испытани-ем в ИФА готовят 10 % суспензию клеща: его растирают металлическим стержнем в той же пробирке, добавляют 0,2 мл РР (см. п. 4.4). Клеща, насосавшегося крови, растирают, добавляя РР в количестве, равном его объёму. Для ИФА берут 0,1 мл суспензии, остаток пробы хранят в той же пробирке и тех же условиях, что и клещей не более 2 недель.

Подготовка крови.
Кровь забирают из вены шприцем в количестве 2-5 мл, переносят в стерильную про-бирку, выдерживают 30-50 мин при температуре 37 оС или 1-2 ч при температуре 18-25 ºС для образования сгустка, затем центрифугируют 15-20 мин при 1500-2000 об/мин. Сыво-ротку отсасывают и помещают в стерильную пробирку, сгусток крови растирают в асепти-ческих условиях, добавляя равное ему по объёму количество РР. Затем центрифугируют при том же режиме, что и кровь. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробир-ку.
Приготовленные пробы маркируют и хранят до исследования при температуре от 2 до 8 оС не более 1 недели или при температуре не выше минус 20 ºС не более 3 мес. В зависимости от цели исследования в ИФА могут быть испытаны как неразведенные пробы сывороток и сгустков крови, так и в разведениях (например, от 1:2 до 1:8).

Подготовка мозговой суспензии.
Для исследования мозга инфицированных животных (или мозговой ткани людей, взятой в случае летального исхода) необходимо приготовить 1 % мозговую суспензию на РР. Суспензию центрифугируют при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин, надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, маркируют и хранят до исследования также как пробы крови. В ИФА проверяют как неразведенную суспензию, так и в разведении 1:10 и выше.

Подготовка культуральной жидкости.
Культуральную жидкость зараженных клеточных культур перед испытанием в ИФА освобождают от клеток центрифугированием при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин. В ИФА исследуют как неразведенные пробы, так и в разведении 1:2 и более.
Подготовка растворов и реагентов (для проведения анализа на одном планшете).

Набор перед использованием необходимо выдержать не менее 30 мин при температу-ре от 18 до 25 °C.

Раствор для разведения ИГ (КББ).
0,5 мл КББ×20 разводят в 9,5 мл воды очищенной или дистиллированной (далее воды). Хранение: неиспользованный концентрат КББ×20 хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 7 сут.

Иммуносорбент (ИГ).
Рабочее разведение ИГ указано на ампуле.
Содержимое ампулы с ИГ растворяют в 1 мл воды (время растворения 1,5 мин при температуре 20-25 оС), затем разводят в КББ (см. п. 4.1) до разведения, указанного на ампу-ле (например: 1:20 – 0,5 мл ИГ и 9,5 мл КББ).
Хранение: неиспользованный растворенный ИГ хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 оС не более 7 сут.

Раствор для промывания планшетов и приготовления РР (ФСБ-Т).
Содержимое флакона с концентратом ФСБ-Т×25 разводят в 480 мл воды. В случае вы-падения осадка концентрат ФСБ-Т×25 предварительно прогревают в течение 20-30 мин при температуре 37 ºС до полного растворения осадка.
Хранение: при температуре от 2 до 8 ºС не более 2 сут или при температуре не выше минус 10 оС не более 14 сут.

Рабочий раствор (РР) для разведения образцов, конъюгата, КА+, КА–.
В 50 мл ФСБ-Т (см. п. 4.3) растворяют навеску 0,5 г стабилизатора БСА (время рас-творения 20 мин при помешивании при температуре 20-25 ºС).
Хранение: при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 7 сут.

Подготовка контрольных образцов.
Содержимое ампул с КА+ и КА– растворяют в 0,5 мл воды (время растворения 1,5 мин при температуре 20-25 ºС), затем готовят рабочее разведение каждого контрольного образ-ца в РР (см. п. 4.4) так, как указано на ампуле (например: 1:200 – 0,01 мл антигена и 2 мл РР).
Хранение: неиспользованные растворенные контрольные образцы хранят при темпе-ратуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 14 сут (рекомендуется разлить на аликвоты в микропробирки для исключения повторного замораживания-оттаивания).

Рабочее разведение конъюгата.
Содержимое ампулы с конъюгатом растворяют в 0,5 мл воды (время растворения
1,5 мин при температуре 20-25 ºС), затем разводят на РР (см. п. 4.4) так, как указано на ам-пуле (например: 1:40 – 0,25 мл конъюгата и 9,75 мл РР). Рабочее разведение конъюгата го-товят не ранее чем за 30 мин до использования.
Хранение: оставшийся не использованным растворенный конъюгат хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 14 сут.

Подготовка рабочего раствора ТМБ.
Рабочий раствор хромогена готовят непосредственно перед использованием, соединяя 2,5 мл концентрата ТМБ и 10 мл ЦБР (разведение 1:5), тщательно перемешивают. Смесь готовят в чистой посуде, избегая контакта раствора с металлом, воздействия интенсивного источника света и близости с хлорсодержащими веществами.
Хранение: при температуре 18-25 ºС не более 15 мин в защищенном от света месте.
4.8. Стоп-реагент (кислота серная концентрации 2 моль/л) в набор не включен, гото-вится дополнительно: к 9 мл воды добавляют 1,2 мл концентрированной кислоты серной.

Проведение иммуноферментного анализа.

Внесение контрольных и исследуемых образцов.
В две лунки планшета вносят по 100 мкл КА+ (в рабочем разведении), в три лунки – КА– (в рабочем разведении), в две лунки – по 100 мкл раствора РР – контроль конъюгата.
В остальные лунки планшета (кроме 12А) вносят по 100 мкл исследуемых образцов. Планшет закрывают и помещают на 1-2 ч при температуре (37±1) ºС или на 18-25 ч при температуре от 2 до 8 ºС, после чего планшеты промывают (см. п.5.1).

Внесение конъюгата.
В каждую лунку планшета, кроме 12А, вносят по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении. Планшет закрывают и помещают на 45-60 мин при температуре (37±1) ºС, затем отмывают 5 раз, остатки влаги удаляют (см. п.5.1).

Внесение хромогена и стоп-реагента.
Во все лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора ТМБ. Планшет выдерживают в защищенном от света месте при температуре 18-25 ºС в течение 5-7 мин до появления интенсивного голубого окрашивания в лунке с КА+, после чего в лунки вносят по 50 мкл стоп-реагента (п. 4.8).

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Белова Оксана Андреевна, Буренкова Л. А., Карань Л. С., Колясникова Н. М., Топычканова Н. Г.

Согласно данным Роспотребнадзора, иммуноферментный анализ (ИФА) выявляет вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) в клещах значительно чаще, чем полимеразная цепная реакция (ПЦР). Цель работы - сравнить эффективность обнаружения ВКЭ в иксодовых клещах разных видов с помощью коммерческих наборов на основе ИФА и ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ). Материалы и методы. Клещи пяти видов были парентерально заражены ВКЭ европейского или сибирского подтипа. из зараженных и незараженных особей составляли зашифрованные серии и в слепом эксперименте анализировали их на наличие ВКЭ с использованием наборов реагентов на основе ИФА и ПЦР-РВ. Результаты. Эффективность детекции ВКЭ обоими методами не зависела от пола, вида клеща и его степени насыщенности кровью. наборы на основе ИФА оказались менее чувствительными, чем на основе ПЦР-РВ. Отмечена зависимость чувствительности ИФА от подтипа ВКЭ. наличие ложноположительных реакций и чувствительность ИФА зависели от протокола проведения анализа. заключение. вопрос о причинах расхождения данных по вирусофорности клещей из природы и снятых с людей, полученных разными методами, остается дискуссионным.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Белова Оксана Андреевна, Буренкова Л. А., Карань Л. С., Колясникова Н. М., Топычканова Н. Г.

The Tick-borne encephalitis virus detection efficiency in the ixodid ticks (Acari: Ixodidae) with elisa and real-time PCR

1. Ahmed R., Oldstone M.B., Palese P. Protective immunity and susceptibility to infectious diseases: lessons from the 1918 influenza pandemic. Nat. Immunol. 2007; 8: 1188-93.

2. Scholtissek C., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives Antiviral Res. 1998; 37: 83-95.

3. Fiore A.E., Fry A., Shay D. et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza. MMWR Recomm. Rep. 2011; 60(1): 1-24.

4. Furuta Y., Takahashi K., Shiraki K. et al. T-705 (favipiravir) and related compounds: Novel broad-spectrum inhibitors of RNA viral infections. Antiviral Res. 2009; 82: 95-102.

5. Hauge S.H., Dudman S., Borgen K. et al. Oseltamivir-resistant influenza viruses A (H1N1), Norway, 2007-08. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15: 155-62.

6. Samson M., Pizzorno A., Abed Y., Boivin G. Influenza virus resistance to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 2013; 98: 174-85.

7. Tisoncik J.R., Korth M.J., Simmons C.P. et al. Into the eye of the cytokine storm. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012; 76: 16-32.

8. Kumar A., Zarychanski R., Pinto R. et al. Critically ill patients with 2009 influenza A (H1N1) infection in Canada. JAMA. 2009; 302: 1872.

9. Perrone L.A., Plowden J.K., Garcia-Sastre A. et al. H5N1 and 1918 pandemic influenza virus infection results in early and excessive infiltration of macrophages and neutrophils in the lungs of mice. PLoS Pathog. 2008; 4: e1000115. doi: 10.1371/journal.ppat.1000115

10. Aoki F.Y., Macleod M.D., Paggiaro P. et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. J. Anti-microb. Chemother. 2003; 51(1): 123-9.

11. Kandun I.N., Tresnaningsih E., Purba W.H. et al. Factors associated with case fatality of human H5N1 virus infections in Indonesia: a case series. Lancet. 2008; 372(9640): 744-9.

12. Darwish I., Mubareka S., Liles W.C. Immunomodulatory therapy for severe influenza. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2011; 9(7): 807-22.

13. Schrofelbauer B., Raffetseder J., Hauner M. et al. Glycyrrhizin, the main active compound in liquorice, attenuates pro-inflammatory re-

sponses by interfering with membrane-dependent receptor signaling. Biochem. J. 2009; 421: 473-82.

14. Tuvim M.J., Gilbert B.E., Dickey B.F., Evans S.E. Synergistic TLR2/6 and TLR9 activation protects mice against lethal influenza pneumonia. PLoS One. 2012; 7(1): e30596. doi: 10.1371/journal. pone.0030596.

15. Harada S. The broad anti-viral agent glycyrrhizin directly modulates the fluidity of plasma membrane and HIV-1 envelope. Biochem. J. 2005; 392: 191-9.

16. Utsunomiya T., Kobayashi M., Pollard R.B., Suzuki F. Glycyrrhizin, an active component of licorice roots, reduces morbidity and mortality of mice infected with lethal doses of influenza virus. Antimicrob. Agents Chemother. 1997; 41(3): 551-6.

17. Michaelis M., Geiler J., Naczk P. et al. Glycyrrhizin inhibits highly pathogenic H5N1 influenza A virus-induced pro-inflammatory cytokine and chemokine expression in human macrophages. Med. Microbiol. Immunol. 2010; 199 (4): 291-7.

18. Smirnov V.S., Zarubaev V.V., Anfimov P.M., Shtro A.A. Effect of a combination of glutamyl-tryptophan and glycyrrhizic acid on the course of acute infection caused by influenza (H3H2) virus in mice. Voprosy virusologii. 2012; 57(3): 23-7. (in Russian)

19. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 1938; 27: 493-7.

20. Alterovitz G., Tuthill C., Rios I., Modelska K., Sonis S. Personalized medicine for mucositis: Bayesian networks identify unique gene clusters which predict the response to gamma-D-glutamyl-L-trypto-phan (SCV-07) for the attenuation of chemoradiation-induced oral mucositis. Oral Oncol. 2011; 47(10): 951-5.

21. Rose W.A. 2nd, Tuthill C., Pyles R.B. An immunomodulating dipeptide, SCV-07, is a potential therapeutic for recurrent genital herpes simplex virus type 2 (HSV-2). Int. J. Antimicrob. Agents. 2008; 32: 262-6.

22. Smirnov V.S., Selivanov A.A. Bioregulators in prophylaxis and treatment of influenza. Sankt-Petersburg: Nauka; 1996. 69 p. (in Russian)

23. Smirnov V. S. Prophylaxis and treatment of influenza and acute respiratory viral infections. Sankt-Petersburg: AYSING; 2010. (in Russian)

Белова О.А.12, БуренковаЛ.А.1, Карань Л.С.3, Колясникова Н.М.1'3, Топычканова Н.Г.4, Кувшинова И.Н.4, Тимофеев Д.И.4, Рукавишников М.Ю.4, Гришаев М.П.4, Карганова Г.Г.12

Эффективность детекции вируса клещевого энцефалита в иксодовых клещах (Acari: 1хо№йаё) с помощью иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции

в реальном времени

Согласно данным Роспотребнадзора, иммуноферментный анализ (иФА) выявляет вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) в клещах значительно чаще, чем полимеразная цепная реакция (ПЦр). Цель работы -сравнить эффективность обнаружения ВКЭ в иксодовых клещах разных видов с помощью коммерческих наборов на основе ИФА и ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ).

Материалы и методы. Клещи пяти видов были парентерально заражены ВКЭ европейского или сибирского подтипа. Из зараженных и незараженных особей составляли зашифрованные серии и в слепом эксперименте анализировали их на наличие ВКЭ с использованием наборов реагентов на основе ИФА и ПЦР-РВ. Результаты. Эффективность детекции ВКЭ обоими методами не зависела от пола, вида клеща и его степени насыщенности кровью. Наборы на основе ИФА оказались менее чувствительными, чем на основе ПЦР-РВ. Отмечена зависимость чувствительности ИФА от подтипа ВКЭ. Наличие ложноположительных реакций и чувствительность ИФА зависели от протокола проведения анализа.

Заключение. Вопрос о причинах расхождения данных по вирусофорности клещей из природы и снятых с людей, полученных разными методами, остается дискуссионным.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита; иксодовые клещи; иммуноферментный анализ; полимеразная цепная реакция в реальном времени; вирусофорность клещей.

The Tick-borne encephalitis virus detection efficiency in the ixodid ticks (Acari: Ixodidae) with elisa and real-time POR

Belova O. A.1,2, Burenkova L. A.1, Karan L. S.3, Kolyasnikova N. M.13, Topychkanova N. G.4, Kuvshinova I. N.4, Timofeev D. 1.4, Rukavishnikov M. Yu.4, Grishaev M. P.4, Karganova G. G12

1Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides, Russian Academy of Medical Sciences, 142782, Moscow, Russia ; 2Lomonosov Moscow State University, 119234, Moscow, Russia; 3Central Research Institute of Epidemiology, Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance, 111123, Moscow, Russia;

4Vector-Best JSC, 630117, Novosibirsk, Russia

Key words: tick-borne encephalitis virus; enzyme-linked immunosorbent assay; real-time polymerase chain reaction; virus prevalence in ticks.

Показатель зараженности клещей вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) имеет огромное значение при составлении эпидемиологической характеристики очага и определении необходимого объема и методов профилактики в эндемичных регионах, а также при определении стратегии индивидуального лечения или профилактики клещевого энцефалита (КЭ) после исследования клещей, снятых с людей. В настоящее время выявление ВКЭ в клещах проводят методами иммуноферментного анализа (ИФА), ОТ-ПЦР и ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ). Показатели зараженности клещей, полученные разными методами, существенно различаются. Согласно данным Роспотребнадзора [1], доля вирусофорных клещей по РФ, собранных в апреле-августе 2011 г, составила 0,17% (136 из 78 995 проанализированных) при анализе клещей методом ПЦР и 5,38% (9308 из 172 919 проанализированных) при анализе клещей методом ИФА.

С помощью ИФА ВКЭ находят в клещах из районов, где никогда не регистрировались и не регистрируются случаи заболевания КЭ. В данной работе мы провели сравнительную оценку чувствительности и специфичности ИФА и ПЦР-РВ.

Материалы и методы

Клетки. Перевиваемую культуру клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) поддерживали при температуре 37°С на среде 199 (ПИПВЭ, Москва) с 5% бычьей сыворотки (Фуро, Россия), как описано ранее [2].

Вирусы. В работе использовали ВКЭ - штамм Абсеттаров (GenBank: AF091005.1; [2]) европейского генотипа, выделенный от больного человека в Ленинградской области, где в основном встречается Ixodes nanus, а также штамм ЭК-328 (GenBank: DQ486861.1; [3]) сибирского генотипа, первоначально выделенный из пула клещей I. persulcatus в 1972 г в Эстонии.

Титрование вируса методом бляшек. Титры вируса определяли методом бляшек под агаровым покрытием в культуре клеток СПЭВ на пластиковых 6-луночных планшетах согласно описанной методике [2, 4]. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл ви-руссодержащего материала.

на четыре инфекции (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора; АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris - FL) на основе ПЦР-РВ.

Заражение клещей. Заражение клещей проводили парентеральным методом, описанным ранее [4, 5]. Клещам вводили под коксу 4-й пары ног культуральную жидкость инфицированных ВКЭ клеток СПЭВ с разной концентрацией вируса. Штаммом Абсеттаров клещей заражали дозами 4 и 6 lg БОЕ/клещ, а штаммом ЭК-328 - в дозе 2 и 4 lg БОЕ/клещ. Самкам и самцам рода Ixodes вводили по 1 и 0,5 мкл вирусной суспензии соответственно, а клещам рода Dermacentor - по 1,5 мкл.

Получение клещевых суспензий. Приготовление клещевых суспензий для их дальнейшего исследования с помощью наборов на основе ИФА и ПЦР-РВ проводили согласно соответствующим инструкциям. Для проведения вирусологических исследований клещей промывали однократно в 70% этаноле и двукратно в физиологическом растворе с 0,1% ципрофлоксацином (Dr. Reddys'), индивидуально растирали пестиком в отдельной ступке, добавляли 600 мкл среды 199 на растворе Эрла (ФГУП ИПВЭ) с антибиотиками (смесь 100 ед/мл пенициллина и 0,0001 г/мл стрептомицина) и переносили в пробирки типа эппендорф. Таким образом, для голодных половозрелых клещей родов Ixodes и Dermacentor были получены 0,14 и 0,58% клещевые суспензии из расчета, что средняя масса особи составляет примерно 0,85 и 3,5 мг соответственно. Для полунапитавшихся клещей этих родов были получены суспензии 4,2 и 7,5% при средней массе клещей, питавшихся 3 дня, 25 и 45 мг соответственно.

Статистическая обработка. В ходе работы использовали непараметрические критерии Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, а также угловой критерий Фишера и точный метод Фишера для малых выборок данных.

Приготовление материала для исследования. Для оценки эффективности выявления ВКЭ наборами на основе ИФА и ПЦР-РВ использовали наиболее распространенные на территории РФ виды клещей, в которых выявляют ВКЭ (табл. 1). Для парентерального заражения клещей использовали ВКЭ европейского (штамм Абсеттаров) подтипа, который чаще всего выявляют в клещах I. ricinus в юго-западной части РФ, а также штамм ЭК-328 сибирского подтипа, переносимый клещами I. persulcatus. Инфекционная доза штамма Абсет-таров составила 4 и 6 lg БОЕ/клещ, а штамма ЭК-328 - 2 и 4 lg БОЕ/клещ. На 5-е и 6-е сутки после заражения из зараженных и незараженных клещей формировали зашифрованные серии клещей и исследовали на наличие ВКЭ в слепом эксперименте коммерческими тест-системами на основе ИФА и ПЦР-РВ согласно инструкциям. Параллельно для определения титра ВКЭ в клещах на данные сутки после заражения проводили исследование клещевых суспензий из аналогичной серии клещей.

Ранее нами показано, что эффективность парентерального заражения клещей близка к 100% [4, 5]. В данном эксперименте при анализе клещевых суспензий методом бляшек эффективность лабораторного заражения клещей была также высокой и составила 96%. Титры вируса в индивидуально исследованных особях варьировали от 2 до 5,9 lg БОЕ/клещ (в одном клеще титр вируса составил 1,5 lg БОЕ). В целом как на 5-е, так и на 6-е сутки титры ВКЭ в клещах были достаточно высокими. При заражении каждым из штаммов разница между средними геометрическими титрами вируса на один срок в разных видах клещей не превышала 1 lg БОЕ, за исключением титра

Средний геометрический титр ВЕЭ в клещах разных видов на 5-е и 6-е сутки после парентерального заражения

Сутки со дня Средний геометрический титр ВКЭ в клещах, lg БОЕ/клещ

Вид клеща заражения штамм ВКЭ

I. ricinus 5-е 5,0 ± 0,2 4,6 ± 0,1

6-е 3,3 ± 0,4 3,6 ± 0,0

I. persulcatus 5-е 4,3 ± 0,1 4,4 ± 0,1

6-е 2,6 ± 0,5 4,3 ± 0,0

D. marginatus 5-е 4,5 ± 0,3 3,6 ± 0,6

6-е 3,6 ± 0,5 4,0 ± 0,3

D. nuttalli 5-е 4,9 ± 0,0 4,4 ± 0,3

6-е 3,0 ± 0,3 2,7 ± 0,8

D. reticulatus 5-е 4,9 ± 0,2 3,7 ± 0,5

6-е 4,3 ± 0,5 4,6 ± 0,1

Всего. 5-е 4,7 ± 0,1 4,1 ± 0,2

6-е 3,3 ± 0,2 3,6 ± 0,3

Примечание. Статистически достоверные различия получены между: титрами ВКЭ на 5-е и 6-е сутки после заражения (критерий Манна-Уитни; р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Всего 4,6 ± 0,1 4,9 ± 0,2 4,0 ± 0,5 4,2 ± 0,2

6-е Самки 3,3 ± 0,3 4,3 ± 0,6 2,9 ± 1,3 4,3 ± 0,2

Самцы 2,4 ± 0,3 4,1 ± 0,6 2,5 ± 1,1 3,8 ± 0,3

Всего 2,8 ± 0,2 4,2 ± 0,4 2,7 ± 0,8 4,0 ± 0,2

П р и м е ч а н и е . Статистически достоверные различия получены между: титрами вируса в клещах обоих полов на 5-е и 6-е сутки после заражения для штамма ЭК-328 в дозе 2 ^ БОЕ и для штамма Абсеттаров в дозе 4 ^ БОЕ (критерий Манна-Уитни; р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Существенное влияние на результат ИФА оказывал субтип использованного для заражения штамма ВКЭ. Так, при дозе обоих штаммов ВКЭ в инокуляте 4 ^ БОЕ/клещ доля отрицательных результатов в ИФА при анализе клещей, зараженных штаммом ЭК-328 (сибирский субтип), составила 5,9% (1/17), а среди клещей, зараженных штаммом Абсеттаров (европейский субтип), - 38,9% (7/18) (см. табл. 3). Разница статистически достоверна (точный метод Фишера; р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

D.nuttalli 17 12 0 3 91,7 100,0

D.reticulatus 11 8 0 0 75,0 75,0

Итого. 112 82 0 3 87,5 89,0

Результаты выявления ВКЭ в клещах с помощью ПЦР-РВ. Для проведения анализа с помощью ПЦР-РВ использовали клещей через 6 дней после заражения. На момент проведения ПЦР-РВ титры ВКЭ в клещах были ниже, чем на момент проведения ИФА (р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

• эффективность детекции ВКЭ обоими методами не зависит от пола, вида и степени насыщенности зараженного клеща;

• метод ИФА менее чувствительный, чем ПЦР-РВ;

• отмечена зависимость чувствительности ИФА от субтипа ВКЭ;

Исследования, представленные в работе, поддержаны грантом РФФИ № 14-04-31716-мол а.

2. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.Iu., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I. et al. GAG-binding variants of tickborne encephalitis virus. Virology. 2010; 398: 262-72.

3. Romanova L.Iu., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D.V., Lukashev A.N., Gmyl L.V. et al. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation. Virology. 2007; 362: 75-84.

4. Belova O.A., Burenkova L.A., Karganova G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially en-

gorged ixodid ticks - Evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks Tick Borne Dis. 2012; 3(4): 240-6.

5. Белова О.А., Козловская Л.И., Романова Л.Ю., Шевцова А.С., Буренкова Л.А. Сравнительный анализ эффективности различных методов заражения иксодовых клещей вирусом клещевого энцефалита. В кн.: Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. М.; 2008; т. 25: 47-52.

2. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.Iu., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I. et al. GAG-binding variants of tickborne encephalitis virus. Virology. 2010; 398: 262-72.

3. Romanova L.Iu., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D.V., Lukashev A.N., Gmyl L.V. et al. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation. Virology. 2007; 362: 75-84.

4. Belova O.A., Burenkova L.A., Karganova G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially engorged ixodid ticks - Evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks Tick Borne Dis. 2012; 3: 240-6.

5. Belova O.A., Kozlovskaya L.I., Romanova L.Yu., Shevtsova A.S., Burenkova L.A. Comparative analysis of the effectiveness of different ixodid ticks' infection methods with TBEV. In: Meditsinskaya virusologiya: Trudy IPVE imeni M.P. Chumakova. Moscow; 2008; vol. 25: 47-52. (in Russian)

В ПОМОЩЬ ВИРУСОЛОГУ

АмосоваИ.В., Соминина А.А., Смирнова Т.Д., СуховецкаяВ.Ф., БузицкаяЖ.В., Войцеховская Е.М.,

Новые моноклональные тест-системы для диагностики

Ключевые слова: аденовирус; моноклональные антитела; диагностические тест-системы.

New monoclonal kits for the diagnosis of the adenoviral infection

Amosova I. V., Sominina A. A., Smirnova T. D., Sukhovetskaya V. F., Buzitskaya Zh. V., Voitsehovskaya E. M.,| Sirotkin A. K. |

Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian Federation, 197376, St. Petersburg, Russia

Diagnostic properties of new monoclonal antibodies (MAbs) to hexon adenovirus antigen (AB) monoclonal ELiSA kit for early diagnosis of adenoviral infection were tested. Developed ELiSA kit and FiTC-conjugate of new monoclonal antibodies for immunofluorescent analysis were used for detection of different types of adenoviruses in clinical materials. The availability of their use in clinical and epidemiological practice was validated.

Key words: adenovirus; monoclonal antibodies; diagnostic kits.