Диагностикум клещевого энцефалита сухой для ртга рск ррг

Цена: по запросу

Вы можете добавить товар в корзину, указав количество

Страна: Россия

Ед. изм.: упаковка

Набор реагентов предназначен для выявления антител к вирусу клещевого энцефалита (КЭ) в образцах сывороток или плазм крови людей и животных в реакции торможения гемагглютинации (РТГА, высокочувствительный анализ), реакции связывания комплемента (РСК, малочувствительный метод) и реакции радиального гемолиза в геле (РРГ, чувствительный метод, выявляющий IgG-антитела даже спустя годы после заболевания). Набор на 200 тестов

Функциональное назначение

Применяется в клинической микробиологии, эпидемиологических исследованиях, производстве иммунобиологических препаратов. Специфическим компонентом набора является диагностикум КЭ, который способен выявлять антитела к вирусу клещевого энцефалита в сыворотках крови (плазме, асцитной жидкости) людей и животных в РТГА, в РСК, в РРГ. Для анализа пригодны пробы сывороток или плазмы крови с добавлением цитрата, гепарина, ЭДТА.

Принцип РТГА: диагностикум КЭ (антиген вируса клещевого энцефалита) способен вызывать агглютинацию взвеси гусиных эритроцитов в зоне слабокислых значений pH. В присутствии сыворотки, содержащей антитела к вирусу клещевого энцефалита, агглютинация тормозится (подавляется), благодаря блокировке ответственного за этот феномен антигена - гемагглютинина (ГА), обычно располагающегося на поверхности вириона.

Принцип РСК: комплекс антиген-антитело обладает способностью связывать комплемент. В реакции участвуют две системы антиген+антитело: специфическая - (диагностикум КЭ + сыворотка крови людей или животных) и индикаторная - (эритроциты барана + гемолизин). При взаимодействии вирусных антигенов с антителами (на первом этапе реакции) с комплексом антиген-антитело связывается комплемент, и он уже не может быть использован для лизиса эритроцитов (которые в смеси с гемолизином добавляют на втором этапе реакции). Таким образом, отсутствие лизиса эритроцитов говорит о положительном результате реакции (наличии антител к вирусу клещевого энцефалита в исследуемом образце).

Принцип РРГ: при взаимодействии с антителами сенсибилизированных вирусным антигеном эритроцитов барана в присутствии комплемента происходит реакция лизиса эритроцитов. Суспензию бараньих эритроцитов обрабатывают диагностикумом КЭ, отмывают и вносят в расплавленный агарозный гель, одновременно добавляя туда комплемент. После перемешивания гель тонким слоем наливают на стеклянную пластину и после затвердения вырезают в нем лунки диаметром 2 мм. В лунки наливают по 5 мкл исследуемой сыворотки (предварительно прогретой для удаления содержащегося в них комплемента). Диффундируя через гель, антитела образуют комплекс с антигеном и комплементом на поверхности эритроцитов, следствием чего является лизис. Вокруг лунок образуется прозрачная зона гемолиза, диаметр которой прямо пропорционален концентрации специфических антител.

Технические характеристики

Состав набора:
1. Диагностикум клещевого энцефалита (диагностикум КЭ) - антиген вируса клещевого энцефалита, полученный из мозга белых мышей, инфицированных вирусом КЭ, методом боратно-солевой экстракции, очищенный протаминсульфатом или фреоном-113, инактивированный бетапропиолактоном, лиофилизованный — аморфный порошок кремового цвета, после растворения - прозрачная жидкость светло-желтого цвета, выпускаемый в комплекте с реагентами для постановки РТГА, РСК и РРГ. Титр специфических гемагглютининов не ниже чем 1:160, комплементсвязывающих антигенов - не ниже чем 1:32 — 10 ампул по 1 мл.
Хранение рабочего раствора: при температуре от 2 до 8 °С не более 1 суток.
2. Положительный контрольный образец для РТГА (К+ РТГА) - асцитная жидкость крыс, иммунизированных живым вирусом КЭ (в виде 10% вируссодержащей суспензии мозга крысят-сосунков) с последующим введением в брюшную полость крыс клеток опухоли яичника крысы для индукции асцита, обработанная хлороформом, каолином и гусиными эритроцитами, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрачная жидкость от светло-желтого до светло-рубинового цвета. Титр антигемагглютинирующих антител - не ниже чем 1:160 — 2 ампулы по 1 мл.
Хранение рабочего раствора: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 суток.
3. Отрицательный контрольный образец для РТГА (К- РТГА) - асцитная жидкость неиммунизированных крыс, индуцированная путем введения клеток опухоли яичника крысы, обработанная хлороформом, каолином и гусиными эритроцитами, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрачная жидкость от светло-желтого до светло-рубинового цвета — 2 ампулы по 1 мл.
Хранение рабочего раствора: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 суток.
4. Положительный контрольный образец для РСК (К+ РСК) - асцитная жидкость крыс, иммунизированных живым вирусом КЭ, обработанная хлороформом, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрачная жидкость от желтого до рубинового цвета. Титр комплементсвязывающих антител не ниже чем 1:32 — 2 ампулы по 0,5 мл.
Хранение рабочего раствора: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 суток.
5. Отрицательный контрольный образец для РСК (К- РСК) - асцитная жидкость неиммунизированных крыс, обработанная хлороформом, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения - прозрачная жидкость от желтого до рубинового цвета — 2 ампулы по 0,5 мл.
Хранение рабочего раствора: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 суток.
6. Смесь солей для приготовления боратного буферного раствора (ББР) pH 9,00±0,05 — таблетка белого цвета массой 1,05+0,02 г, в состав которой входят: натрия хлорид - 0,7 г; кислота борная - 0,32 г; кальция стеарат или магния стеарат (наполнитель)
- 0,03 г. 1 таблетка рассчитана для получения 100 мл раствора ББР. По 1 таблетке в пакете из ПЭ пленки — 3 пакета.
Хранение рабочего раствора: не более 2 недель при температуре от 2 до 8 °С. 4 % раствор натрия гидроксида хранят при температуре 20-25 °С в пластиковом флаконе не более 14 суток, в стеклянном флаконе - не более 7 суток.
7. Смесь солей для приготовления фосфатного буферного раствора (ФБР) pH 6,20+0,05 — таблетки белого цвета общей массой 4,12+0,08 г, в состав которых входят: натрия хлорид - 0,88 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 1,06 г; натрий фосфорнокислый однозамещенный двуводный - 2,06 г; кальция стеарат или магния стеарат - 0,12 г. 1 таблетка рассчитана для получения 100 мл раствора ФБР. По 4 таблетки в пакете из ПЭ пленки — 2 пакета.
Хранение рабочего раствора: не более 2 недель при температуре от 2 до 8 °С.
8. Смесь солей для приготовления раствора Альсевера или Гепарин, раствор для внутривенного и подкожного введения 5000 МЕ/мл (ФСП 42-0504-7813-06) — 1 ампула (1 мл).
Смесь солей для приготовления раствора Альсевера - таблетки белого цвета общей массой 5,30+0,10 г, в состав которых входят: кислота лимонная моногидрат - 0,8 г; натрий лимоннокислый трехзамещенный моногидрат - 2,26 г; глюкоза - 2,2 г; кальция стеарат или магния стеарат - 0,04 г. 1 таблетка рассчитана для получения 100 мл раствора. По 5 (6) таблеток в пакете из ПЭ пленки — 1 пакет.
Хранение рабочего раствора: не более 2 недель при температуре от 2 до 8 °С.
9. Каолин (белая глина) по ГФ X, ст. 109 — 2 стакана по 30 г или 1 стакан по 60 г.
Хранение рабочего раствора: при температуре от 2 до 8 °С в течение любого времени.
В коробку с набором вкладывают инструкцию по применению и нож или скарификатор ампульный. При упаковке ампул, имеющих кольцо излома или точку для вскрытия, нож ампульный или скарификатор ампульный не вкладывают.
Набор реагентов необходимо хранить при температуре от 2 до 8 °С.
Срок годности 3 года со дня изготовления. Набор реагентов с истекшим сроком годности использованию не подлежит.

Набор реагентов рассчитан на исследование 200 сывороток одновременно в трех тестах: РТГА, РСК, РРГ. Смеси солей для приготовления растворов и каолин, предназначенные для постановки РТГА, приложены в количестве, рассчитанном для исследования 200 или 350 сывороток при их предварительной обработке в объеме 100 мкл или 50 мкл соответственно.

ДИАГНОСТИКУМЫ (греч, diagnostikos способный распознавать) — взвеси обезвреженных микроорганизмов, используемые в качестве антигенов для серологических реакций. Опасность работы с живыми культурами, их способность к изменчивости и наличие широких антигенных связей делают целесообразным применение Д.— более стандартных и гомогенных препаратов, содержащих определенные антигенные компоненты.

С помощью Д. в реакциях агглютинации, пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) и др. выявляют специфические антитела в сыворотках людей и животных с целью постановки диагноза и изучения иммунного состояния организма.

Особенно широко используют Д. в лабораторных исследованиях при кишечных инфекциях. Однако общность антигенной структуры кишечных бактерий обусловливает наличие перекрестных реакций и требует дифференцированного выявления антител. С этой целью проводят избирательное подавление отдельных антигенов: с помощью фенола или формалина подавляют О-агглютинабельность, как предложили Феликс и Олицкий (A. Felix, L. Olitzki, 1928). Воздействуя спиртом по способу Вина и Зонтага или прогреванием по Кауффманну, получают O-диагностикумы с инактивированным жгутиковым антигеном. Еще более перспективно применение моно диагностикумов, принцип создания которых разработан Ф. Г. Бернгофом (1944). В этих препаратах содержится лишь один антигенный компонент, и они взаимодействуют только с определенными специфическими антителами.

Показана возможность сохранения свойств бактериальных Д. путем их лиофилизации (см.).

Д., применяемые для серодиагностики различных инфекций, принципиально сходны, однако отдельные виды этих препаратов имеют определенную специфику.

Общепризнано, что РПГА более чувствительна и специфична, чем бактериальная агглютинация. В качестве антигенов в РПГА применяют формалинизированные эритроциты, сенсибилизированные антигенами, полученными по методам Буавена и Вестфаля.

Вирусные Д. применяют в основном в реакции связывания комплемента (РСК), РТГА и реакции нейтрализации. Готовят их из вируссодержащих культуральных жидкостей, обработанных (инактивированных) различными способами.

Краткая характеристика основных Д. и сфера их применения представлены в таблице.

Имеются также экспериментальные препараты, используемые в научной работе: эритроцитарные колидиагностикумы, дифтерийные эритроцитарные Д., гемагглютинирующие антигены вирусов паротита, коревой Гемагглютинирующий антиген и др.

Таблица. Краткая характеристика основных диагностикумов и цель их применения

Цель применения (используется сыворотка обследуемого)

Диагностикумы из бактерий семейства кишечных: шигелл Флекснера, Зонне, Ньюкасла; сальмонелл тифа (ОН, О), паратифа А и В, холеры су ис, тифимуриум, энтеритидис

Микробная взвесь (3 млрд. микробных тел в 1 мл), инактивированная 0,4—0,5% р-ром формалина

Постановка реакции агглютинации для уточнения клин, диагноза заболевания

Сальмонеллезные О-диагностикумы (2, 4, 7, 8, 9 и 3, 10)

Микробная взвесь, содержащая парциальный О-антиген (3 млрд. микробных тел в 1 мл),полученная из селекционированных штаммов, инактивированная 15% р-ром глицерина

Постановка реакции агглютинации для выявления О-антител при сальмонеллезах

Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы (а, b, с, d, eh, с, k, lv, gm, p, st и антигены второй фазы — 1, 2, 5, 6, 7)

Микробная взвесь, содержащая компоненты жгутикового антигена 1-й и 2-й фаз (3 млрд. микробных тел в 1 мл), полученная из селекционированных штаммов, инактивированная 0,5% р-ром формалина

Постановка реакции агглютинации для выявления Н-антител с диагностической целью и для установления заболевания в анамнезе

Микробная взвесь (3 млрд. микробных тел в 1 мл) из штаммов, содержащих Vi-фактор, обработанная 0,4% р-ром формалина и 0,6% р-ром хлорида кальция

Постановка реакции агглютинации для выявления брюшнотифозного бактерионосительства

Бруцеллезный единый диагностикум

Взвесь бруцелл в 12% р-ре поваренной соли, окрашенная в синий цвет и инактивированная 0,5% р-ром фенола

Постановка реакции агглютинации (реакция Райта и реакция Хаддлсона для выявления инфицированных людей и животных— см.Бруцеллез, методы исследования)

Микробная взвесь (25 млрд. микробных тел в 1 мл) вакцинного штамма, инактивированная 0,5% р-ром формалина

Постановка объёмно-капельной реакция агглютинации на стекле для серодиагностики и изучения иммунного состояния привитых

Лиофилизированная микробная взвесь 11 штаммов наиболее распространенных серотипов

Постановка РСК для подтверждения клин, диагноза заболевания

Корпускулярные антигены — взвесь риккетсий, выращенная в желточных мешках куриных эмбрионов или легочнориккетсиозный материал от зараженных грызунов, обработанный эфиром, целитом или при дифференциальном центрифугировании

Постановка реакции агглютинации для дифференциальной диагностики риккетсиозов

Эритроцитарные диагностикумы из шигелл Флекснера — Зонне

Формалинизированные эритроциты, сенсибилизированные антигенами Буавена, Вестфаля и др.

Эритроцитарный сальмонеллезный Vi-диагностикум

Формалинизированные эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеном

Постановка РПГА для выявления брюшнотифозного бактерионосительства

Эритроцитарные сальмонеллезные О-диагностикумы (1, 2, 12; 1, 4, 12; 6, 7; 6, 8; 1, 9, 12; 3, 10 и комплексный)

1% взвесь формалинизированных эритроцитов, сенсибилизированных антигенами Буавена, Вестфаля и др.

Лиофилизированный туляремийный эритроцитарный диагностикум

Формалинизированные лиофилизированные эритроциты, сенсибилизированные туляремийным антигеном

Постановка РПГА для уточнения клин., диагноза туляремии, а также реакции нейтрализации антител для обнаружения: антигена

Антиген вируса осповакцины

Сухой препарат живого вируса осповакцины, культивированного на хорион-аллантоисной оболочке куриных эмбрионов

Постановка РПГА для выявления антигемагглютининов у больных и привитых

Аденовирусный специфический антиген

Готовят культивированием вируса 6 типа в культуре перевиваемых клеток А-1 (антиген, общий для всех аденовирусов)

Постановка РСК для выявления комплементсвязывающих антител в сыворотке больных

Диагностикумы клещевого энцефалита и этиологически сходных с ним заболеваний

Вируссодержащая суспензия мозга белых мышей, осветленная путем центрифугирования и инактивирования бета-пропилактоном

Постановка РСК и РТГА для уточнения клин, диагноза заболевания

Сухой препарат из кипяченых вируссодержащих желточных мешков куриных эмбрионов, экстрагированных эфиром, осажденных ацетоном и инактивированных мертиолатом

Постановка РСК для диагностики орни-тоза людей, птиц и животных

Гриппозный диагностикум сухой

Аллантоисная жидкость развивающихся куриных эмбрионов, инфицированных одним из штаммов вируса гриппа типа А, В или С, инактивированная формалином, мертиолатом. В связи с изменчивостью антигенной структуры вируса гриппа предусмотрена частая смена производственных штаммов

Постановка РТГА для уточнения клин., диагноза заболевания

Парагриппозный диагностикум типа 1, 2, 3 для РТГА, сухой

Культуральная жидкость (почки эмбриона человека), содержащая один из штаммов вируса парагриппа, обработанная твином-80, эфиром и мертиолатом

Постановка РТГА для уточнения клин, диагноза заболевания

Библиография: Зуев А. С. Бактериальный vi-диагностикум для выявления хронических носителей брюшнотифозных бактерий, Журн, микр., эпид, и иммун., № 2, с. 51, 1959, библиогр.; Зуев А. С., Новоселова А. И. и Ликина И. В. Разработка методики производственного изготовления О-диагностикумов и Н-монодиагностикумов и применение их при серодиагностике салмонеллезов, там же, № 3, с. 42, 1956; Иммунология и профилактика кишечных инфекций, под ред. С. И. Диденко, с. 180, М., 1962; Каральник Б. В. Эритроцитарные диагностикумы, М., 1976; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, с. 172, М., 1973; Субботина Ю. Л. и д р. Серологическая диагностика сальмонеллезов и антигенные связи в реакциях с эритроцитарными и бактериальными О-диагностикумами, Журн, микр., эпид, и иммун., № 3, с. 19, 1970, библиогр.

Полезная информация для каждого

В течение многих лет в России для экстренной серопрофилактики и лечения клещевого энцефалита (КЭ) применяется препарат Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита. В 60–80-е годы прошлого столетия были проведены многочисленные исследования по доказательству профилактических и лечебных свойств этого препарата [1–4].

В Инструкциях по медицинскому применению отечественных вакцин против КЭ представлены специальные схемы вакцинации для доноров, обеспечивающие получение в короткие сроки регламентированного уровня специфических антител в плазме крови доноров [5–7]. Отечественный препарат Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита представляет собой концентрированный раствор очищенной фракции иммуноглобулинов, выделенных методом фракциониро- вания этиловым спиртом при температуре ниже 0ºС из плазмы крови здоровых доноров, содержащей антитела к вирусу КЭ.

Иммунологические свойства: действующим началом препарата являются иммуноглобулины класса G, обладающие активностью антител, нейтрализующих вирус клещевого энцефалита. Препарат также повышает неспецифическую резистентность организма [8, 9].

В готовом препарате фракция иммуноглобулинов должна составлять не менее 97% от общего белка. Со- держание белка в иммуноглобулине – от 10 до 16%. Титр антител к вирусу КЭ в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) – не менее 1:80 [8, 10, 11].

Цель работы – изучить возможность применения иммуноферментного анализа для выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ и дать дополнительную характеристику специфической активности препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефа- лита в ИФА по титру специфических иммуноглобулинов класса G.

Для выполнения этой цели были проведены следующие исследования:

II. Подбор условий проведения иммуноферментного анализа для выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в препарате Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита при использовании отече- ственных наборов реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ, предназначенных для исследования сывороток (плазмы) крови человека.

Подтверждение пригодности отработанной мето- дики постановки ИФА для иммуноглобулинов класса G при параллельном исследовании серий препарата с использованием наборов реагентов для ИФА отечественного и зарубежного производства.

III. Титрование образцов 58 серий препарата Имму- ноглобулин человека против клещевого энцефалита методом ИФА для определения содержания иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ для дополнительной характеристики специфической активности препарата.

Материалы и методы

агглютинацию эритроцитов гуся [11, 14]. Гемагглютинирующая активность и выбор рабочей дозы антигена для РТГА проводится в реакции гемагглютинации (РГА) с взвесью гусиных эритроцитов по учёту феномена агглютинации эритроцитов. При использовании образцов сывороток (плазмы) крови, содержащих антитела к вирусу КЭ, агглютинация тормозится (подавляется), благодаря блокировке ответственного за этот феномен.

8. Эритроциты гусей для постановки РТГА. Примечание: Образцы серий вышеуказанных различных иммуноглобулинов, плазмы для фракциони- рования были предоставлены для выполнения этого исследования из Лаборатории иммуноглобулинов и препаратов крови Испытательного Центра МИБП ФГБУ

1. Титрование образцов препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита – регламентированным методом РТГА (Инструкция по применению набора реагентов Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ) [11].

В состав набора реагентов для РТГА в качестве основного компонента входит инактивированный бета-пропиолактоном антиген вируса клещевого энцефалита, полученный методом боратно-солевой экстракции из мозга белых мышей, инфицированных вирусом КЭ, штамм № 139, обладающий способностью вызывать антигена – гемагглютинина (ГА), обычно располагающегося на поверхности вириона [11]. В РТГА используется рабочая доза антигена вируса КЭ – 8 ГАЕ.

До постановки в РТГА образцы исследуемых препа- ратов иммуноглобулинов: Иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита, Иммуновенина, Пентаглобина, Плазмы для фракционирования, субстанция предварительно обрабатывали для удаления неспецифи- ческих гемагглютининов и ингибиторов гемагглютинации 25% взвесью каолина и 0,4% взвесью гусиных эритроцитов. В результате проведенной обработки было получено исходное разведение каждого образца – 1:10, из которого далее готовили на боратном буферном растворе разведения от 1:20 до 1:1280. За титр антител в каждом исследуемом образце иммуноглобулина принимали максимальное разведение препарата, при котором наблюдали визуально полную задержку гемагглютинации (-) с рабочей дозой антигена, при контрольном титровании которой наблюдается гемагглютинация не менее чем на 3+.

Для проведения ИФА с образцами препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита и других препаратов иммуноглобулинов готовили разведения каждого исследуемого препарата от 1:400 до 1:25600 на растворе для разведения сывороток из комплекта набора.

Таблица 1. Состав диагностических наборов реагентов для РТГА и ИФА, предназначенных для выявления антител (иммуноглобулинов) к вирусу клещевого энцефалита

Биологические реагенты, входящие в состав диа- гностических наборов

Набор реагентов для РТГА

Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобули- нов класса G к вирусу клещевого энцефалита

Антиген вируса клещевого энцефалита, полученный методом боратно-солевой экстракции из мозга белых мышей ин- фицированных вирусом КЭ, очищенный протаминсульфатом, инактивированный

Планшет разборный с иммобилизо- ванным антигеном вируса КЭ

2. К+ (положительный кон- трольный образец)

К+ (РТГА) – асцитная жидкость крыс, иммунизированных живым вирусом КЭ, обработанная хлороформом, као- лином и гусиными эритроцитами

К+ (положительный контрольный образец, инактивированный)

Не входит в состав набор

3. К– (отрицательный кон- трольный образец)

К– (РТГА) – асцитная жидкость неим- мунизированных крыс, обработанная хлороформом, каолином и гусиными эритроцитами

К– (отрицательный контрольный образец, инактивированный)

Не входит в состав набора

4. Калибровочные раство- ры, содержащие иммуногло- булины класса G к вирусу КЭ

Не входят в состав набора

Калибровочные растворы, содержа- щие IgG к вирусу КЭ в концентрациях от 10 до 160 ЕД/ мл*

Стандарты IgG к вирусу КЭ от 0 до 300 NTU/ml** (TBE/FSME IgG)

5. Растворы для разведения образцов

Смесь солей (таблетка) для приготов- ления боратного буферного раствора (ББР) рН 9,0 ± 0,05;

Смесь солей (таблетка) для приготов- ления фосфатного буферного раство- ра (ФБР) рН 6,2 ± 0,05

Растворы для разведения сывороток (РПРС – для предварительного раз- ведения и РРС – раствор для разве- дения)

Растворы для разведения сывороток (IgG pH 7,2 ± 0,2)

Конъюгат антител к иммуноглобулинам человека, меченых пероксидазой хрена

TBE/FSME anti-IgG конъюгат- связанные с пероксидазой антитела к IgG человека

Раствор тетраметилбензидина (рас- твор ТМБ)

ТМБ субстрат (раствор TMB) 3,3,5,5- тетраметилбензидин

8. Промывочные растворы

Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т×25)

20-кратный концентрат буферного раствора рН 7,2 ± 0,2

Стоп-раствор – 0,2 М раствор серной кислоты

10. Результьы анализа

(–) полное оседание эритроцитов (от 3+ до 4+) гемагглютинация эритроцитов

Результаты ИФА регистрируют, изме- ряя величину оптической плотности растворов в лунках на спектрофото- метре вертикального сканирования в двухволновом режиме 450/620 нм

Для сравнения и оценки специфичности положительных результатов ИФА для препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита в опыте ИФА в разведении 1:400 и более параллельно исследовали образцы препаратов иммуноглобулинов человека нормальных (Пентаглобин, 1 серия, Иммуновенин, 2 серии, образцы Плазма для фракционирования, субстанция, 2 серии), которые по данным РТГА не содержали антитела к вирусу КЭ (титр менее 1:10).

Воспроизводимость полученных результатов ИФА оценивали при параллельном титровании образцов в разведениях 1:400–1:25600 трёх серий (в трех повторах) препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита.

рис. 2. определение уровня иммуноглобулинов класса G к вирусу кЭ в образцах иммуноглобулина человека против кЭ, методом ИФА. Воронкова Г.М., Николаева С.П., Захарычева Т.А., Воробьева М.С., Шарыгин С.Л. Лечебный эффект донорских специфических иммуноглобулинов при клещевом энцефалите // Биопрепараты. 2005. № 2 (18). С. 15.

Для зарубежного набора,согласно Инструкции по применению [13], расчет активности (титр) специфического иммуноглобулина класса G проводили при сравнении значений ОП разведений исследуемых образцов препарата со значениями ОП калибровочных стандартов, входящих в комплект этого набора реагентов.

Состав диагностических наборов реагентов для РТГА и ИФА представлен в таблице 1.

2. Методы статистической обработки и анализа полученных результатов. Определяли значение среднеарифметической величины титров и ошибку средней ОП [17–19].

Для статистической характеристики результатов экспериментов выбрана медиана – показатель, позволяю- щий статистически охарактеризовать ряд анализируемых значений и который можно применять для любого типа распределений данных [18]. Применение медианы

Результаты представлены в таблице 2 и на рис. 1. Как видно из представленных данных, все образцы

Большинство образцов серий имели титры антител – 1:160, 1:320, единичные образцы имели титр – 1:640, что соответствовало паспортным данным.

Количество исследованных серий

Титр антител к вирусу КЭ в РТГА (показатель активности по НД – не менее 1:80)*

I. Подбор условий проведения ИФА для выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в препарате Им- муноглобулин человека против клещевого энцефалита.

Первоначально исследовали образцы одной серии препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, образцы двух серий препарата Иммуновенин, образец одной серии препарата Пентаглобин и двух серий Плазмы для фракционирования, субстанция.

Вышеуказанные препараты разводили раствором для разведения сывороток, входящим в состав набора реагентов для ИФА. Для постановки ИФА был использован ряд разведений образцов препаратов от 1:400 до 1:25600, так как в предварительных исследованиях было показано, что для более низких разведений.

Наименование препарата

Показатели ОП растворов в лунках соответствующих разведений образцов препаратов:

Иммуноглобулин человека против КЭ

Иммуновенин (иммуноглобулин человека нормальный)

Пентаглобин (иммуноглобулин человека нормальный)

Плазма для фракционирования серия № 6

Плазма для фракционирования серия № 7

Примечания. Критерии оценки результатов ИФА (Инструкция по применению набора реагентов) Показатели оптической плотности ОП 450/620 нм:

К+ (положительный контрольный образец) – не менее 0,8; К– (отрицательный контрольный образец) – не более 0,2; Учет результатов анализа:

ОПкрит. = ОПср.К– + 0,1;

ОПобр. ≥ ОПкрит. (результат анализа положительный); ОПобр.

Серия Иммуно- глобулина чело- века против клещевого энцефалита

Количество исследованных образцов

Показатели ОП растворов в лунках соответствующих разведений образцов разведения

1. Контрольные образцы:

ОПкрит. = ОПср.К– + 0,1;

Серия Иммуногло- булина человека против клещевого энцефалита

Количество исследованных образцов

Показатели ОП растворов в лунках соответствующих разведений образцов разведения

Примечания. Критерии оценки результатов ИФА (Инструкция по применению набора реагентов):

Показатели оптической плотности (ОП 450/620 нм): Контрольные реагенты:

-стандарты (NTU/мл) * * 0 NTU/мл 0,200

Учет результатов анализа:

Положительный результат ˃110 NTU/мл Отрицательный результат 110 NTU/мл, для отрицательного – значение 110 NTU/мл) и отрицательные значения в реакции ИФА при значении ОП = 0,223,что соответствовало 50 NTU/мл (т.е. менее 55 NTU/мл).

Сравнивая эти значения ОП калибровочных стандар- тов с данными ОП при тестировании образцов трех серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, определяли положительный или отрицательный результат ИФА в соответствую- щем разведении исследуемого образца иммуноглобулина. Так ИФА реакция была положительной (ОП = 0,600; 0,620; 0,670) для разведения препарата 1:3200;

в разведении 1:6400 (ОП = 0,330; 0,350; 0,380) реакция определялась как серая зона, т.е. неопределенный результат.

Для определения в ИФА концентрации иммуноглобулина класса G к вирусу КЭ в образцах серий пре- парата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита в перспективе необходима разработка стандартного образца (СО) иммуноглобулина против клещевого энцефалита, калиброванного по содержа- нию специфического иммуноглобулина класса G в еди- ницах активности.

Таблица 6. Определение иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита в ИФА (набор реагентов

Производство (филиалы НПО «Микроген)

Количество исследованных серий

Титр антител (иммуноглобулинов класса G) к вирусу КЭ в ИФА*

*За титр иммуноглобулина класса G в исследуемом образце препарата принимали максимальное разведение, при котором в ИФА значение оптической плотности в лунках было равно или более ОП критической (ОПкрит.); вычисление значения ОПкрит. проводилось по формуле в соответствии с Инструкцией по применению набора.

КЭ многими российскими специалистами [15, 16].

Нами было проведено тестирование образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита в вышеуказанном наборе ре- агентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулина класса G. Использовали подобранное нами исходное разведение (1:400–1:800) исследуемых образцов этого препарата.

Результаты представлены в таблице 6 и на рисунке 2. На представительном количестве образцов серий препарата Иммуноглобулин человека против клеще- вого энцефалита показана возможность выявления специфических иммуноглобулинов класса G по титру – соответствующему максимальному разведению препарата с положительным результатом анализа.

Согласно данным таблицы 6 и рисунка 2, наибольшее количество образцов серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита содержало иммуноглобулины класса G к вирусу КЭ в титре 1:12800 и 1:25600, образцы 7 серий – в титре 1:6400.

Таким образом, при исследовании образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита показано, что титры иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в ИФА превышают в 10–40 раз титры антител, определяемых в РТГА.

2. Подобраны условия проведения ИФА для выяв- ления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в препарате Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита. Подтверждена специфичность выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ параллельными исследованиями препаратов иммуноглобулинов человека нормальных (Иммуновенин, Пентаглобин, Плазма для фракционирования, субстанция), не содержащих антитела к вирусу КЭ по данным РТГА.

3. Воспроизводимость метода ИФА в применении к титрованию препарата Иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита подтверждена при па- раллельном титровании образцов трех серий препара- та в трехкратном повторении в двух наборах реагентов для ИФА отечественного и зарубежного производства.

1. Козлова И.В., Злобин В.И., Воробьева М.С., Верхозина М.М. Иммуноглобулины и тест-системы для профилактики и диагностики клещевого энцефалита // Экспресс-диагностика и экстренная профилактика иксодовых клещевых инфекций. М. 2009.

З. Пеньевская Н.А. Оценка эффективности этиотропной профилактики инфекций, передающихся клещами: проблемы теории и практики. Омск. 2010. 229 с.

4. Субботина Л.С. Результаты использования метода ELISA при изучении клещевого энцефалита и бешенства // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1985. № 1. С. 73–77.

5. Билалова Г.П. Вакцина клещевого энцефалита

8. Инструкция по применения лекарственного препарата для медицинского применения Иммуноглобу- лин человека против клещевого энцефалита.

9. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 2010. гл. 6. раздел 6.4.

10. Фармакопейная статья предприятия ЛС-001279- 010811: Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, раствор для внутримышечного введения.

11. Инструкция по применению набора реагентов Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ.

13. Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита

14. Островская Л.А., Верета Л.А., Мжельская Т.В. и др. Штамм вируса клещевого энцефалита № 139 для приготовления гемагглютинирующего инактивированного диагностикума (Авт. Свидетельство на изобретение № 107 / 1634 от 8.10.83).

15. Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Бархалева О.А. и др. Иммунный ответ при экспресс-иммунизации против клещевого энцефалита вакцинами

// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2009.

16. Николаева С.П., Воронкова Г.М., Мжельская Т.В. и др. Специфическая диагностика клещевого энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов в Хабаровском крае // Биопрепараты. 2005. № 2 (18). С. 11.

17. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Изд-во медицинской литературы, 1962. С. 16.

18. Гланц С. Медико-биологическая статистика, М. 1999. С . 32–36.

19. ГОСТ Р ИСО 16269-2004: Статистическое представление данных. Медиана.

Читайте также: