Рассеянный склероз иммунологические аспекты

До настоящего времени нет единого мнения о природе иммунологических факторов, вызывающих демиелинизацию, т. е. о гуморальных пли клеточных факторах.

РАССЕЯННЫЙ СКЛЕРОЗ: ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РАЗВИТИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Авторы показали, что представлениям о решающей роли в развитии демиелинизирующих пора­жении нервной системы, ГЗТ и экспериментальным дан­ным (специфичность кожно-аллергических реакций кор­реляция между ними и развитием патологического про невозможность переноса экспериментального заболевания посредством сывороток) противостоят резуль­таты морфологических исследований, показавших, что вос­палительный процесс не совпадает топографически повреждении с демиелинизацией.

Значение ГЗТ в патогенезе экспериментальных аллер­гических заболеваний нервной системы заключается в раз­витии повышенной проницаемости сосудов, что способст­вует действию миелинотоксических антител.

На вопросе о специфической роли глии в процессах демиелинизации следует остановиться специально.

Классиками нейрогистологии еще в конце XIX и на­чале XX века было сделано предположение о тесной связи миелинового волокна со шванновской клеткой в перифери­ческой нервной системе и с олигодендроглией в централь­ной нервной системе. Об этом упоминали Б. С. Дойни­ков (1911), Н. В. Коновалов (1939), Del Rio-Hortega (1922).

С 50-х годов настоящего столетия стали высказываться основательные суждения о том, что причину избирательной демиелинизации при рассеянном склерозе следует искать в патологии олигодендроглиальной ткани или шванновских клеток, поскольку образование миелина непосредст­венно связано с деятельностью этих тканевых элементов.

В более поздних работах (Bunge, 1968) демиелинизация и возможная ремиелинизация также рассматриваются как реакции, связанные с глиальными элементами. В оте­чественной литературе Д. А. Марковым (1969) представ­лены электронно-микроскопические данные в пользу учас­тия олигодендроцитов в формировании миелинового слоя. Результаты исследований М. И. Пашковской (1973) свидетельствуют о раннем участии олигодендроглии в реакции де- и ремиелинизации.

Гистологическими исследованиями установлено, что в очагах демиелинизации при рассеянном склерозе олиго- дендроглиальные клетки изменены. Электронно-микроскопические исследования (Peters, 1960) свидетельствуют о том же.

Комплексные биохимические и электронно-микроскопические исследования Robertson (1960), В. Л. Боровягина (1963) и др., а также исследования с применением метода рентгеноструктурного анализа (Finean, 1958) показали, что основной период формирования миелиновой структуры соответствует периоду сдвоенной мембраны шванновской или олигодендроглиальной клетки.

В дальнейшем положение об участии глиальных элементов в процессе демиелинизации получило развитие и в работах, выполненных с помощью гистохимических и экспериментальных иммунологических методов исследо­вания. Friede (1962), Friede с соавторами (1961) произвели гистохимические исследования энзиматической активности мозга больного, умершего от рассеянного склероза. Ими установлено, что в глиальных клетках в очагах демиелинизации выпадают окислительные ферменты, такие, как кислая фосфатаза и др. Активность окислительных ферментов в аксонах, стенках кровеносных сосудов и эпен­диме не изменялась при демиелинизации. Участки мозга с небольшим количеством глиальных клеток, с низкой ферментативной активностью в них и с преимущественной локализацией ферментативной активности в аксонах были более резистентны к демиелинизации, чем участки мозга, имеющие противоположные характеристики. Авторы дела­ют вывод, что демиелинизации при рассеянном склерозе связана с повреждением некоторых функций глиальных клеток на биохимическом уровне, на котором используют­ся липиды для построения миелиновой оболочки. Сам по себе синтез липидов, по мнению этих авторов, при рассеян­ном склерозе не страдает.

По данным Wender, Korik (1969), гистоэнзиматические изменения при рассеянном склерозе были также выражены в области олигодендроглиальных клеток. Rinne (1968) с помощью электронномикроскопического исследования в участках мозга, взятых при стереотаксической операции у больной рассеянным склерозом по поводу выраженного тремора, установил наибольшие изменения в олигодендро­глиальных клетках.

Н. Н. Боголепов (1973) показал, что глиальные клетки являются наиболее реактивной частью нервной системы в отношении внешних воздействий.

Эксперименты с тканевой миелиновой культурой, сви­детельствующие об избирательном поражении олигоден­дроглиальных клеток и миелина, на которых мы останав­ливались выше, нашли дальнейшее развитие при изу­чении сыворотки и ликвора больных рассеянным скле­розом.

Работами Bornstein (1963), Berg, Kallen (1965) показа­но, что обнаруженный ими глиотоксический эффект, хотя и не был строго специфическим для рассеянного склероза, однако наблюдался при нем с большим постоянством в от

личие от контрольной группы больных с травмами и сосу­дистыми поражениями.

Lumsden считал, что действие сыворотки больного рас­сеянным склерозом специфично для миелина. Глиальный лизис по его данным наступал позднее.

Весьма интересны факты, сообщенные Bornstein в 1963 г. и касающиеся некоторой обратимости процесса демиелинизации, возникшей in vitro. Оказалось, что участ­ки ремиелинизации напоминали, по мнению автора, бляш­ки рассеянного склероза.

Pette с соавторами (1965) инкубировали культуру клеток с активной антисывороткой и полу­чили цитотоксический эффект в отношении указанных клеток. Этим самым они показали, что мембранолизис является иммунопатологическим процессом. Инокуляции кроликам шванновской тканевой культуры, как антигена,

с прибавлением адъюванта вызывала у них демиелинизацию периферических нервов. Цитолитическое вещество было идентифицировано как лизолецитин. Высказано предположение, что иммунный комплекс (реакция анти- реп — антитело + комплемент) вызывает тотальное увели­чение лизолецитина, которое ведет к разрушению клеточ­ных мембран, включая миелиновый слой.

Е. Paltrinieri (1968) также упоминает о повреждаю­щем влиянии лизолецитина на нервные клетки. Указан­ные исследования представляются нам чрезвычайно перс­пективными в изучении механизмов аллергических реак­ций при рассеянном склерозе.

Если присутствие гуморальных антимозговых антител при рассеянном склерозе доказывается множеством работ, то патогенетическая их роль пока еще полностью не ясна. Скорее всего она неоднозначна; по-видимому, зависима от фазы заболевания и вы­зывает либо повреждения нервной ткани, либо реализует защитно-компенсаторные возможности организма. О по­вреждающем действии противомозговых антител можно судить на основании корреляции клинических проявлений заболевания и титра указанных антител. Однако подобные клинико- иммунологические корреляции отнюдь не обязательный признак обострений или тяжелого течения рассеянного склероза, что отмечают многие авторы.

Глиотоксический и демиелинизирующий эффект сыво­ротки крови больных рассеянным склерозом обнаруживали Burnet (1959), Berg, Kallen (1964), Bornstein, Appel (1965) в культуре ткани мозга. Однако другими авторами было обращено внимание на то, что в условиях целостного организма при ЭАЭ отмечается выраженный защитный эффект сыворотки в отличие от повреждающего действия in vitro.

Возможно, что степень проницаемости гематоэнцефалического барьера определяет роль противомозговых антител. При повы­шенной его проницаемости образование комплекса антиген — антитело происходит в нервной ткани, повреж­дая ее.

Таким образом, анализ многочисленных работ, посвя­щенных патогенезу рассеянного склероза, позволил наме­тить основные направления, которые легли в основу изучения рассеянного склероза как инфекционно-аллергиче­ского заболевания.

При рассмотрении инфекционного генеза рассеянного склероза, помимо иммунологического, прежде всего сле­дует иметь в виду эпидемиологический аспект заболева­ния. Это тем более важно, так как на основании различных статистических методов установлен факт неравномерного распределения рассеянного склероза в различных геогра­фических зонах.

Основные работы, опубликованные по этому поводу, свидетельствуют о том, что наименьшее число заболевших приходится на область экватора или зоны, близкие к нему. Dean и соавторы (1949) сообщили, что в странах южной Африки рассеянный склероз — редкое явление.

Положение о малой распространенности заболевания в областях, близких к экватору, в основном остается в силе, хотя существуют и исключения. Как особенности клиниче­ской картины, были отмечены: редкость появления класси­ческих форм рассеянного склероза; частое поражение зри­тельных нервов; клиническое и анатомическое сходство с болезнью Девика (в Японии). В северных широтах и, в частности, в Скандинавских странах, заболевание встре­чается гораздо чаще.

Limburg (1950) дал сводку по ряду стран (США, Анг­лия, Голландия, Австралия) по степени смертности от рассеянного склероза. Он сообщает, что в северных районах США и Канаде смертность от рассеянного склеро­за на 100 000 населения значительно выше, чем в южных штатах США. Им были установлены заметные различия между северным и южным полушариями. Соотношение рассеянного склероза в северных широтах по отношению к южным равно, н® Kurland (1952), 3:1. Kurland было установлено, что для всей Канады и для большинства штатов США, расположенных выше 40-й параллели, смертность от рассеянного склероза составляла 1 на 100 000 населения. Для штатов, расположенных ниже 40-й параллели, эти показатели значительно снижались. Установлено, что в областях, где температура в январе достигала 30 , смертность от рассеянного склероза выше, чем в более южных областях. Автор подтверждает положе­ние, что рассеянный склероз — болезнь холодного и уме­ренного климата. Allison (1961) также указывает, что заболевание преобладает в холодном и умеренном климате и сравнительно редко в тропическом и субтропическом.

Существуют данные, что зависимость заболеваемости от географической широты наблюдается только в северном полушарии. Okinaka с соавторами (1958) не нашли соот­ношения между частотой рассеянного склероза и географи­ческой широтой в Японии. В южном полушарии болезнь встречается редко, но особенно это относится к странам, расположенным в области экватора.

Предполагавшееся ранее полное отсутствие рассеянного склероза в области экватора и прилегающих к нему частях земного шара теперь подтверждается не вполне. Это можно объяснить лучшей диагностикой заболевания и большим вниманием к этому вопросу. Все же на основании большо­го числа работ можно считать, что заболевание встречает­ся в этих областях реже, нежели в других. Так что наибо­лее общим положением, которое оспаривается лишь немногими авторами, да и то на основании сравнения заболеваемости в крупных городах, является связь заболевае­мости рассеянным склерозом с географической широтой.

Несмотря на разнообразие результатов, полученных отдельными авторами, что связано скорее всего с отсутст­вием стандартизированного подхода к вопросам диагно­стики, а, следовательно, и выявления заболевания, факт неравномерного распределения рассеянного склероза в за­висимости от географической широты существует. Второе обстоятельство, которое надо иметь при этом в виду, со­стоит в том, что распределение заболеваемости рассеян­ным склерозом по земному шару не напоминает ни одну из существующих инфекций и потому не дает оснований считать его связанным с какой бы то пи было уже извест­ной бактериальной или вирусной инфекцией.

Вместе с тем появляются работы, в которых обращает­ся внимание на известную локальность в распределении больных рассеянным склерозом.

Следует упомянуть данные, представленные X. П. Саа­ром (1961), утверждавшим, что территориальное распро­странение рассеянного склероза в прибалтийских странах совпадает с таковым в отношении некоторых нейровирусных инфекций.

Panolius с соавторами (1969) рассмотрели тот же во­прос в Финляндии. При этом не было обнаружено корре­ляций между географическим преобладанием рассеянного склероза и распространением инфекционных детских забо­леваний у тех же больных.

Гипотеза о том, что рассеянный склероз приобретается за долгий срок до развития клинической картины заболе­вания, нашла подтверждение в эпидемиологической работе Malter, Okihiro (1971). Авторы изучали рассеянный скле­роз у мигрантов и установили, что его частота среди населения, мигрировавшего на Гаваи, зависела от воз­раста больных. Рассеянный склероз встречался в 5 раз чаще среди мигрировавших после 15-летпего возраста по сравнению с теми, кто мигрировал до этого возраста. Это различие особенно заметно среди приехавших на Гаваи из северных штатов США, где риск рассеянного склероза наиболее высок, и был менее заметным среди приехавших из южных штатов, где рассеянный склероз редок. Эти дан­ные свидетельствуют о том, что время появления рассеян­ного склероза относится скорее всего к 15-летнему возрас­ту. Они косвенно подтверждают также точку зрения и о том, что рассеянный склероз вызывается инфекционны­ми агентами с длительным латентным периодом, а возмож­но и медленно действующими вирусами.

Таким образом, в эпидемиологии заболевания отсутст­вуют четкие подтверждения его инфекционного генеза, за исключением отдельных работ о фокусном распределении очагов заболеваемости и упоминаний относительно воз­можного действия ультрафиолетовых лучей на вирусы и бактерии. В экваториальных и приэкваториальных стра­нах, где солнечная радиация велика, ее действие на воз­можные возбудители рассеянного склероза более эффек­тивно.

Запись на прием к нейрохирургу

Уважаемые пациенты, Мы предоставляем возможность записаться напрямую на прием к доктору, к которому вы хотите попасть на консультацию. Позвоните по номеру ,указанному вверху сайта, вы получите ответы на все вопросы. Предварительно, рекомендуем Вам изучить раздел О Нас.

1) Позвонить по номеру 8-863-322-03-16.

1.1) Или воспользуйтесь звонком с сайта:

Согласно литературным и собственным данным, изменения иммунологического статуса у пациентов с PC находятся в зависимости от стадии заболевания, характера его течения и проводимой терапии. Специалисты Российского Государственного Медицинского Университета (проф. Демина Т.Л. и др., Москва, 1998) по данным собственных исследований делают следующие выводы: 1) клинические и иммунологические изменения взаимосвязаны, но иммунологические изменения опережают клинические; 2) ряд изменений в иммунной системе являются адаптационными и не нуждаются в коррекции; 3) для PC характерна большая! вариабельность показателей иммунитета и использование одного или двух иммунологических параметров не позволяет определить стадию активности патологического процесса; 4) изменения иммунологических показателей взаимосвязаны в рамках определенной стадии активности процесса, определить которую можно на основе системного анализа показателей иммунных реакций; 5) смена стадий иммунопатологического процесса при PC происходит согласно определенным закономерностям, но при этом имеются выраженные индивидуальные особенности; 6) центральное место в иммунорегуляции занимает цитокиновый статус, во многом определяющий стадию активности процесса.
Данные о субпопуляциях лимфоцитов в крови и ликворе больных PC достаточно противоречивы. Наиболее часто сообщается о снижении CD8+ лимфоцитов во время обострения PC и за несколько дней до обострения (Reinherz E.L.et al., 1980, Huddlestone J.R., Oldstone В.A.,I 1982; Sandberg-Wolheim M., 1983; Werner H.L. et al., 1984; Craig J.C. et al.,1985). По данным Гусева Е.И. и др. (1992) снижение CD8+ клеток с одновременным повышением содержания клеток с СВ4-рецептором наблюдалось только у больных с тяжелым течением PC. Этими же авторами было отмечено повышение содержания CD4+ клеток в ликворе больных PC.
Нарушение иммунорегуляцпп при PC проявляется также при исследовании неспецифической супрессорной активности. Получены данные о снижении супрессорной активности клеток, стимулированных Кон-А при обострении PC с возвращением до контрольных показателей при выходе из обострения (Balashov K.E., Weiner H.L., 1994; ВаlashovK.E. et al., 1995).
Недостаточность супрессорных систем проявляется и в снижении способности Т-клеток больных PC контролировать продукцию Ig всех классов В-клетками in vitro, особенно при активном PC (Oger J. et al., 1986). Повышение продукции иммуноглобулинов клеточными структурами больных PC можно расценивать как проявление активации В-клеток in vivo; последствиями такой активации могут быть олигоклональные Ig и наличие свободных легких цепей Ig в ликворе больных (Тотолян Н.А. и др., 1991; Тотолян Н.А., 1993). Выявление олигокло-нальных групп IgG в ликворе не является специфичным для PC тестом. Эти IgG могут быть выявлены у больных с различными воспалительными заболеваниями мозга, неврологическими проявлениями СПИДа и другими заболеваниями. В то же время, около 5% больных с клинически достоверным PC могут не иметь олигоклональные группы IgG в ликворе (Zemen A. et al, 1996), а специфичность олигоклональных Ig может меняться по мере развития заболевания. Повышенное содержание легких цепей Ig каппатипа имеют от 80 до 95% больных PC. В диагностически сложных ситуациях при нарушенной проницаемости гемато-энцефалического барьера более информативен расчет индекса легких цепей. Этот тест позволяет подтвердить диагноз PC в 95% случаев, а на стадии ранних клинических проявлений (1-3 месяца) – в 85% случаев (Sindick С Laterre E.,1991; Тотолян Н.А., 1998).
Сорокин A.M. и соавторы (1987), Чекнев С.Б. и соавторы (1990), Гусев И.Е. и соавторы (1992) отмечают снижение цитотоксической активности естественных киллерных (ЕК) клеток у больных PC без четкой зависимости от клинического состояния больных.
В лаборатории нейроиммунологии Института мозга человека РАН проводится подробное изучение иммунологического статуса у пациентов с ремиттирующей формой рассеянного склероза в разные периоды течения заболевания (И.Д.Столяров и др., 1998). Мы придерживаемся следующего определения периодов заболевания (Е.И.Гусев и др., 1997):

• обострение–появление нового симптома пли группы симптомов или отчетливое ухудшение уже имевшихся симптомов после того, как неврологическое состояние больного было стабильным или улучшалось на протяжении не менее месяца;
• ремиссия – отчетливое улучшение состояния больного в виде уменьшения выраженности или исчезновения симптома и/или симптомов, которое должно длиться не менее 24 часов (при длительности ремиссии более 1 месяца она может определяться как стойкая);
• стабилизация – отсутствие обострений, ремиссий или хронического прогрессирования на протяжении по крайней мере 1 месяца.

В период обострения заболевания обнаруживается незначительное снижение зрелых Т-лимфоцитов (CD3+), преимущественно за счет субпопуляции супрессорных/цитотоксических клеток (CD8+) (таблица 11), а также повышение пролиферативной и функциональной активности клеток в ответ на митогены.
В период ремиссии при нормализации количества CD3+ лимфоцитов значительно повышается уровень CD8+ субпопуляции лимфоцитов по сравнению с показателями в контрольной группе. Следствием дисоаланса регуляторных субпопуляций является снижение иммунорегуляторного индекса (отношение CD4+ к CD8+), свидетельствующее о нарушении! дифференцировки иммуноцитов. При исследовании функциональных показателей обнаружено угнетение ответа лимфоцитов на митоген лаконоса (PW) на 42% и снижение спонтанного включения ЗН+-тимидина на 57% в сравнении с соответствующими показателями у доноров. Угнетение пролиферативного ответа сопровождалось повышением cynpecсорной активности лимфоцитов: спонтанная супрессорная активность составила 312% от нормы, Кон-А-индуцированная – 243% от нормы. Фагоцитарная активность нейтрофилов в НСТ-тесте имела следующие особенности: наблюдалось снижение резервного коэффициента на 40% по сравнению с донорами, в основном за счет повышения уровня базального НСТ, который составил 321% от нормы. Обнаружена дисиммуноглобулинемия: содержание IgA было снижено до 43%, IgM повышено до 172% от нормы. Отмечено снижение цитотоксической активности ЕК.
Субпопуляция CD22+ лимфоцитов, отражающая состояние гуморального иммунитета, претерпевала незначительные изменения, не выходя за границы нормальных значений во все периоды заболевания.
Реконституция иммунной системы завершается в период стабилизации заболевания, когда все показатели приобретают нормальные значения, достоверно не отличающиеся от значений в контрольных группах. Это касается и уровня сенсибилизации лимфоцитов к мозгоспецифическим антигенам (основному белку миелина – ОБМ, антигену нейрональных мембран, галактоцереброзидам-С 1 типа, белку S-100) в реакции торможения адгезии лейкоцитов (РТАЛ) (см. таблицу 2). В периоды обострения и ремиссии сохраняется гиперчувствительность лимфоидных клеток к этим антигенам, особенно выраженная к ОБМ, а в период стабилизации происходит нормализация данных показателей.

Таблица 11
Уровень субнопуляций Т- и В-лимфоцитов у больных PC в разные периоды заболевания (M±m)

Показатель	Обострение (n=16)	Ремиссия (n =20)	Стабилизация (n =18)	Доноры (n =30)
CD3+%	42,31±2,641	53,48+2,77	54,78±1,33	59,30±2,1
CD4 +%	30,38±2,341	33,30±2,83	37,61±1,00	39,10+1,9
CDS +%	11,94+1,171	18,9+2,181	17,17±0,87	19,60±1,8
CD4+/ CD8 +	2,85+0,31	1,42±0,23	2,32+0,15	1,99±0,09
CD22+%	15,06±0,44	17,85±0,43	17,50+0,53	18,4±1,6

Примечание: * - достоверное различие при сравнении результатов пациентов с PC и доноров при р

На правах рукописи

Иммунологические аспекты формирования вакцинального Т-клеточного ответа у больных рассеянным склерозом

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук,

доктор медицинских наук

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН (ИИФ УрО РАН)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН ( 4).

диссертационного совета

доктор биологических наук

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Патогенез рассеянного склероза (РС) до конца не ясен, тем не менее, аутоиммунная природа этого заболевания не вызывает сомнения. Установлено, что триггерная роль в развитии РС принадлежит аутоиммунным Т-лимфоцитам, распознающим поверхностные антигены клеток нервной ткани (основной белок миелина, протеолипидный белок, ассоциированный с миелином гликопротеин, олигодендроцитный миелиновый гликопротеин и др.). Продукция ряда провоспалительных цитокинов (интерферон-гамма; интерлейкин-17, интерлейкин-2 и др.) наряду с прямым повреждающим действием патологических лимфоцитов, запускает миелин - деструктивный процесс, который впоследствии приводит к тяжелым неврологическим нарушениям и инвалидизации больного. (Steinman L., 2008; Giuliani F.,2003.)

Стандартное системное лечение РС базируется на использовании препаратов (гормоны, цитостатики, интерфероны), обладающих неспецифическим (неселективным) иммунодепрессивным действием. Такое лечение подавляет не только патологические, но и “полезные” иммунные процессы, стоящие на страже здоровья организма. Следствие неселективной иммунодепрессии - серьезные побочные эффекты, резко ограничивающие возможности влияния на патологический процесс.

Очевидно, что будущее в лечении не только РС, но и других аутоиммунных заболеваний связано с разработкой новых методов лечения, нацеленных на избирательную инактивацию аутоиммунных лимфоцитов. Т - клеточная вакцинация – один из наиболее реальных и перспективных подходов к лечению аутоиммунных заболеваний.(HongJ.,2006; Hermans G.,1999; Correale J.,2008 Hafler D.,1992) Вариабельные участки антигенных рецепторов Т-лимфоцитов формируются в постнатальный период. Это означает, что по отношению к этим рецепторам не формируется врожденной иммунологической толерантности. (Vandenbark A. A.,2008) Установлено, что индуцированный иммунногенной частью Т - клеточного рецептора иммунный ответ способен избирательно инактивировать идиотип - несущие лимфоциты, поэтому иммунизация аутологичными, клонированными, миелин - реактивными Т-клетками индуцирует у больных РС антиидиотипический Т - клеточный ответ, одним из элементов которого является генерация антиклонотипических цитолитических CD8+ Т-клеток способных избирательно инактивировать Т-лимфоциты, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие идиотипические структуры. (Sarantopoulos S.,2004). Экспериментально показано, что Т - клеточная вакцинация также индуцирует генерацию антиклонотипических и антиэрготипических CD4+ Т-клеток, которые в активированном состоянии продуцируют ИЛ - 4 и ИЛ-10(, 2006; Astier A. L.,2006; Hong J.,2006;) и, таким образом, препятствуют развитию тканедеструктивных процессов.

Цель исследования. Охарактеризовать влияние поликлональной Т - клеточной вакцинации на патологические аутоиммунные процессы, определяющие течение и прогрессирование рассеянного склероза как аутоиммунного заболевания

Задачи исследования.

Охарактеризовать субпопуляционный состав, функциональные свойства и иммунологическую специфичность вакцинальных лимфоцитов, полученных посредством чередования специфической и неспецифической стимуляции мононуклеарных клеток (МНК) крови больных РС in vitro. Оценить влияние поликлональной Т - клеточной вакцинации на субпопуляционный состав и миелин - специфическую реактивность МНК крови больных РС. Оценить уровень INF-γ и ИЛ-4 в сыворотке крови и супернатантах МНК больных РС в процессе вакцинотерапии. Охарактеризовать функциональные свойства Т-лимфоцитов, реактивных по отношению к вакцинальным Т-клеткам. Оценить безопасность и побочные эффекты применения Т - клеточной вакцинации в лечении РС.

Научная новизна. Впервые охарактеризованы фенотипические и функциональные свойства Т-клеток, входящих в состав индивидуальных поликлональных Т клеточных вакцин. Так же охарактеризовано влияние поликлональной Т - клеточной вакцинации на баланс про и противовоаспалительных цитокинов в сыворотках крови больных рассеянным склерозом. Показано увеличение концентрации ИЛ-4 и уменьшение концентрации INF-γ в сыворотках крови вакцинированных пациентов.

Показано изменение пролиферативной активности МНК (мононуклернных клеток крови) вакцинированных пациентов в ответ на стимуляцию их миелиновыми антигенами через год после начала вакцинотерапии. Из крови пациентов были впервые получены Т - клеточные линии реактивные по отношению к миелин - реактивным Т-лимфоцитам. Показана их иммуносупрессорная активность. У части больных рассеянным склерозом выявлены повышенные уровни сывороточных антител к основному белку миелина и другим нейротропным антигенам и показано, что Т - клеточная вакцинация может приводить к их снижению до нормальных значений.

Научная и практическая значимость. Полученные данные свидетельствуют, что уровни идиотипических детерминант, имеющиеся в поликлональной, миелин - реактивной Т - клеточной вакцине, достаточны для индукции антиидиотипических иммунных ответов, способных подавлять клональную экспансию миелин - реактивных Т-лимфоцитов в организме больного рассеянным склерозом. Препятствием для развития тканедеструктивного воспаления могут быть также индуцируемые Т - клеточной вакцинацией системные иммунологические сдвиги, приводящие к повышению концентрации ИЛ-4 в сыворотке крови вакцинированных больных и снижению INF-γ. С практической точки зрения важно, что разработанная лечебная технология не требует клеточного клонирования. Она позволяет в течение относительно короткого времени (10-14 дней) получить индивидуальную Т - клеточную вакцину в количестве, достаточном для индукции поликлонального антиидиотипического ответа и проведения полноценного курса лечения.

Также показано, что длительность иммунного ответа на вакцинальные клетки после индуцирующего курса вакцинотерапии, состоящей из 4 вакцинаций, не превышает 1 года. Эти данные указывают на целесообразность максимально возможной пролонгации курса вакцинотерапии.

В рамках клинического исследования показана безопасность применения индивидуальных поликлональных Т - клеточных вакцин при лечении рассеянного склероза. Получены данные, предполагающие клиническую эффективность

Основные положения, выносимые на защиту.

Поликлональная Т - клеточная вакцинация индуцирует иммунные процессы, препятствующие течению аутоиммунного заболевания. Поликлональная Т - клеточная вакцинация сдвигает проявления иммунного ответа в сторону доминирования Тh-2 реакций.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 85 страницах машинописного текста включающего 9 таблиц и 11 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 94 литературных источника (89 иностранных).

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Третьем Российском конгрессе по патофизиологии (Москва 2004г), на Международном Междисциплинарном Семинаре (Таиланд 2006г), на Втором съезде неврологов (Новосибирск 2007г), на VII конференции иммунологов Урала (Архангельск 2009г.)

Результаты работы отражены в 4 публикациях, из них три статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Материалы и методы исследования.

Пациенты. Клинические исследования проводились в соответствии с протоколом, утвержденным Ученым советом и Этическим комитетом Института клинической иммунологии СО РАМН. От каждого пациента, участвующего в исследовании, было получено информированное согласие.

Иммунотерапевтическое лечение было проведено 28 больным церебро - спинальной формой РС в возрасте от 18 до 54 лет с давностью заболевания не менее 2 лет. У 3 больных имело место ремиттирующее, у 4 – прогредиентно - ремиттирующее, у 4 – первично - прогредиентное и у 17 – вторично - прогредиентное течение заболевания. Диагноз РС был установлен клинически и подтвержден магнитно-резонансным исследованием. Неврологический статус пациентов оценивался по функциональной шкале Куртцке с использованием расширенной шкалы инвалидизации (EDSS). Пациенты не получали иммуносупрессивную терапию, по крайней мере, в течение 6 месяцев до начала лечения, а также на всем его протяжении.

Сывороточные уровни MBP - специфичных (идиотипических) и антиидиотипических антител (АТ) были определены у 17 пациентов с ремиттирующим и у 17 пациентов с прогредиентным течением заболевания.

Иммунологические исследования.

Миелин был приготовлен по стандартному методу Deibler из нервной ткани головного мозга свиньи. По данным электрофореза полученный миелин имел 90% гомологию с коммерческим миелином, используемым в качестве образца.

Приготовление поликлональной Т - клеточной вакцины. Разработанная технология получения Т - клеточной вакцины состоит из двух последовательных этапов. Первый этап включает в себя культивирование мононуклеарных клеток (МНК) пациента в концентрации 2млн/мл, выделенных на градиенте фиколл-верографин из 250 мл крови, в присутствии миелина (50 мкг/мл) в течение 7 дней, тогда как второй – наращивание миелин - реактивных Т-лимфоцитов посредством неспецифической митогенной стимуляции фитогемагглютинином (ФГА, 5мкг/мл) и рекомбинантным человеческим интерлейкином-2 (IL-2, Ронколейкин, 100 ед/мл) дополнительно в течение 3 дней. После культивирования клетки инактивировали облучением и хранили в жидком азоте до момента использования. Общее количество полученных от одного больного клеток варьировало в пределах 18-27 ´ 107.

Т - клеточная вакцинация.

Индуцирующий курс иммунотерапии состоял из 4 еженедельных подкожных Т - клеточных вакцинаций в межлопаточную область. Поддерживающее лечение включало в себя вакцинации с интервалом в один месяц. Одна вакцинальная доза составляла 18 миллионов клеток.

Приготовление антиидиотипической клеточной популяции.

Для получения антиидиотипической популяции лимфоцитов, МНК, выделенные из периферической крови вакцинированных больных, в концентрации 2 млн,/мл, культивировали совместно с миелин – реактивными облученными вакцинальными Т-лимфоцитами (1млн/мл) в соотношении 2:1. Через 7 дней в культуру вносили 2×106 /мл облученных МНК в качестве антиген-презентирующих клеток и продолжали клеточное культивирование в присутствии рекомбинантного ИЛ-2(100Ед/мл) еще семь суток. Далее прокультивированные клетки облучали (2000рад) и оценивали их супрессорную активность в пролиферативном тесте.

Пролиферативные тесты.

2. Для оценки миелин - индуцированного пролиферативного клеточного ответа, МНК (2×106 /мл) культивировали с миелином (50 мкг/мл) или без него в контроле в течение 120 ч. Клеточную пролиферацию оценивали стандартным методом по включению [3Н] тимидина.

3. Для оценки специфичности антиидиотипического пролиферативного ответа 2×106/мл МНК, выделенных из периферической крови вакцинированных больных, культивировали в течение 72 часов совместно с облученными миелин - реактивными (вакцинальными) лимфоцитами (2×106 /мл). В контроле к МНК вместо вакцинальных клеток добавляли клетки, специфичные к коллагену суставной ткани (2×106 /мл) , которые были получены по той же методике, что и миелин - реактивные клетки.. Клеточную пролиферацию оценивали стандартным методом по включению [3Н] тимидина.

Цитофлюориметрический анализ.

Определение содержания цитокинов в исследуемых образцах.

Определение уровня нейротропных антител. Антитела определяли в сыворотках крови с использованием ЭЛИ-Тестов производства Медицинского исследовательского центра “Иммункулус”, согласно инструкциям производителя.

Результаты и обсуждение.

На начальном этапе мы определили концентрацию миелина, которая позволяет получить максимально возможный пролиферативный ответ МНК, полученных из периферической крови больных РС. Полученная концентрация составляла 50мкг миелина на 1 мл крови. Миелин в такой концентрации был использован для получения Т - клеточной вакцины двуэтапным методом (см материалы и методы).

Цитофлюориметрический маркерный анализ показал, что содержание в вакцине Т - клеток с фенотипом СD4+ составляет 46-65%, тогда как с фенотипом CD8+ 25-35%. Процентное содержание NK - клеток и В-лимфоцитов не превышает 9% и 3%, соответственно. 40% вакцинальных клеток экспрессирует маркер CD45RO. Наличие маркера СD45RO на вакцинальных клетках указывает на возможное участие в патологическом процессе клеток памяти. Далее мы прокультивировали вакцинальные Т - клетки в течение 72 часов совместно с облученными (2000рад) аутологичными МНК в присутствии 50мкг\мл миелиновых или контрольных антигенов (белок мышиной меланомы) для оценки специфичности полученной вакцины. Пролиферативный ответ вакцинальных клеток на миелин в два раза превышал ответ на контрольный антиген мышиной меланомы. Таким образом, вакцинальные Т-лимфоциты обладают выраженной реактивностью по отношению к миелиновым антигенам (табл.1).

Таблица 1 Пролиферативная активность вакцинальных Т-лимфоцитов в ответ на стимуляцию миелиновыми или контрольными антигенами

Уровень пролиферации вакцинальных Т-клеток